強痛寧對大鼠中樞腦區NO/cGMP信號轉導通路影響

尹柏雙 ， 宋永利 ， 呼顯生 ， 沙萬里 ， 石星星 ， 高 利 ， 付連軍

(1.吉林農業科技學院動物醫學學院 ， 吉林吉林132101；2.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

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強痛寧對大鼠中樞腦區NO/cGMP信號轉導通路影響

尹柏雙1， 宋永利1， 呼顯生1， 沙萬里1， 石星星2， 高 利2， 付連軍1

(1.吉林農業科技學院動物醫學學院 ， 吉林吉林132101；2.東北農業大學動物醫學學院 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為了研究強痛寧麻醉下大鼠中樞腦區一氧化碳合酶(NOS)活性、NO和環烏苷酸(cGMP)濃度變化，探討強痛寧麻醉鎮痛的中樞作用機理。將24只SD大鼠隨機分成4組，分別為對照組、誘導期、麻醉期和催醒期組，于不同時期采集大鼠大腦皮質、小腦、腦干、海馬和丘腦。采用比色法測定NOS 活性和NO含量，酶聯免疫吸附法測定cGMP濃度。結果表明，腹腔注射強痛寧6 mg/kg體重后，麻醉期各腦區NOS活性顯著降低(P<0.05或P<0.01)；NO產量與對照組比較降低極顯著(P<0.01)；cGMP濃度降低顯著(P<0.05 或P<0.01)。結果提示，強痛寧抑制大鼠中樞腦區NOS活性，阻斷NO/cGMP信號轉導可能是其產生全麻作用的重要機理之一。

強痛寧 ； 一氧化氮合酶 ； 一氧化氮/環鳥苷酸 ； 信號轉導

NO/cGMP信號轉導通路可將胞外信號轉導至細胞核，參與肌肉收縮、細胞生長和分化等生理過程[1]，是胞內重要的信號通路之一[2]。其通路中的氣體信號分子一氧化氮(NO)，具有激活鳥苷酸環化酶，提高環鳥苷酸含量，維持細胞間信號傳遞功能[3]。環鳥苷酸(cGMP)起到傳遞細胞內信息作用[4]，一氧化氮合酶(NOS)是NO生成的關鍵酶[5]。研究發現，NO/cGMP信號轉導通路介導了麻醉藥對神經突觸作用，產生麻醉鎮痛現象[6-7]。強痛寧是一種麻醉性鎮痛劑，由延胡索乙素、三七、高烏甲素、蟾蜍、冰片等成分組成的復方中藥制劑，具有無依賴性、成癮性和耐受性優點，對呼吸功能產生輕度抑制，在人類疼痛性疾病的強烈疼痛期有所應用[8-9]。在動物臨床麻醉中，強痛寧作為復合麻醉或復合麻醉劑的組成部分，被廣泛應用于犬、貓等寵物的臨床麻醉[10]。而強痛寧產生麻醉鎮痛作用機理無人報道。本試驗旨在探討強痛寧麻醉下大鼠中樞腦區NOS活性、NO和cGMP含量變化，擬從NO/cGMP信號轉導通路揭示強痛寧麻醉鎮痛作用分子學機理。

1 材料與方法

1.1 試驗藥品及主要試劑 強痛寧(浙江省醫學科學院，批號130719)；NOS測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130815)；NO測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130812)；考馬斯亮藍蛋白質含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20130816)；Rat cGMP Elisa Kit(南京建成生物工程研究所，批號：20130915)。

1.2 實驗動物與分組 SD純種大鼠24只，體重200±20 g，雌雄兼備，吉林大學實驗動物中心提供，同一條件下飼養2 周后進行試驗。隨機取6只作為生理鹽水對照組(腹腔注射1.2 mL/kg體重生理鹽水)，其余大鼠為試驗組(腹腔注射6 mg/kg體重強痛寧溶液)。

1.3 樣品采集和處理 對照組大鼠腹腔注射生理鹽水后3 min斷頭取腦，試驗組大鼠腹腔注射強痛寧后分別于誘導期(注藥后5 min即可)、麻醉期(翻正反射消失即可)、催醒期(翻正反射恢復即可)斷頭取腦，在生理鹽水冰面上迅速分離大腦皮層、海馬、丘腦、小腦和腦干，分別稱重，裝入凍存管后投入液氮中保存。分別將腦組織取出置入冰冷的蔗糖緩沖液(0.32 mol/L，1/10，W/V)介質中勻漿，2 500 r/min離心10 min制備成10%腦組織勻漿液，待測。

1.4 檢測方法 采用比色法測定NOS酶活性和NO產量，酶聯免疫吸附法(ELISA)測定cGMP濃度，考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。檢測具體方法參照各檢測試劑盒的操作說明書進行。

2 結果

2.1 強痛寧對大鼠中樞腦區NOS活性的影響結果如圖1所示，強痛寧給藥后抑制了大鼠中樞腦區NOS活性，麻醉全程大鼠大腦、小腦、腦干、海馬及丘腦腦區NOS活性與對照組比較降低顯著(P<0.01或P<0.05)；催醒期僅丘腦NOS活性恢復到麻前水平(P>0.05)。

圖1 強痛寧作用下大鼠中樞腦區NOS活性變化

2.2 強痛寧對大鼠中樞腦區NO含量的影響由圖2可見，強痛寧作用下引起大鼠中樞腦區NO產量減少，麻醉全程大鼠小腦、腦干、海馬及丘腦腦區NO含量與對照組比較降低顯著(P<0.01 或P<0.05)；催醒期小腦NO 含量仍低于對照組(P<0.05)。

圖2 強痛寧作用下大鼠中樞腦區NO含量變化

2.3 強痛寧對大鼠中樞腦區cGMP濃度的影響 按照cGMP 試劑盒操作步驟繪制吸光值與cGMP濃度的直線回歸方程為y=0.341 7+0.059 4x(R2=0.990 2)，相關系數較高，線性回歸良好。cGMP濃度變化見圖3，強痛寧引起大鼠麻醉期中樞各腦區內cGMP濃度降低，與對照組比較差異顯著(P<0.05或P<0.01)；崔醒期大鼠大腦、海馬、丘腦和腦干cGMP濃度恢復到麻前水平(P>0.05)。

圖3 強痛寧作用下大鼠中樞腦區cGMP濃度變化

3 討論

NO與cGMP構成NO/cGMP信號轉導通路，NO參與機體生理機能的調節，在維持清醒狀態和促進cGMP合成起著重要作用[11]。中樞神經通路的興奮性和抑制性與NO/cGMP信號轉導通路關系密切，中樞神經系統(CNS)通過調節中樞NO/cGMP通路使神經細胞內cGMP含量升高引起興奮性，cGMP含量下降引起中樞抑制[12]。

過去研究發現，多數麻醉藥產生麻醉鎮痛作用均與NO/cGMP信號轉導通路抑制相關。王洪斌等研究結果發現，噻環乙胺麻醉下大鼠大腦皮層、海馬和丘腦NOS活性被抑制，導致NO和cGMP含量下降，提示噻環乙胺麻醉與NO/cGMP信號轉導通路被抑制相關[7]；劉煥奇等研究表明，NO-NOS-cGMP信號轉導通路參與了賽拉唑產生全麻作用[13]；胡興國等研究表明，異丙酚抑制大鼠小腦、海馬和大腦皮層NOS活性，減少腦區NO產量和cGMP含量，提示NO/cGMP信號轉導通路在異丙酚全麻分子機理中發揮重要作用[14]。本研究結果表明，腹腔注射強痛寧6 mg/kg體重后，引起麻醉期中樞腦區NOS 活性顯著降低，NO產量和cGMP含量降低，提示NO/cGMP信號轉導通路參與了強痛寧全麻分子機理調控。

4 結論

本研究結果表明，強痛寧抑制大鼠中樞腦區NOS活性，降低NO產量和cGMP含量，阻斷NO/cGMP信號轉導可能是其產生全麻作用的重要機理之一。

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Effects of the QIANG TONG NING on NO/cGMP Signal Pathway in in the Central Brain Regions of Rats

YIN Bai-shuang1， SONG Yong-li1， HU Xian-sheng1，SHA Wan-li1， SHI Xing-xing2， GAO Li2， FU Lian-jun1

(1.Department of Animal Medicine，JiLin Agricultural Science and technology，Jilin 132101，China；2.College of Animal Medicine，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

The experiment was conducted to investigate the possible molecular mechanisms of QIANG TONG NING(QTN)anesthesia on the central nervous system by analyzing the NOS activity，NO and cGMP contents in central brain regions in rats.Twenty-four SD rats were divided randomly into control group，induction group，anesthesia group,and recovery from anesthesia group.Rat brain samples of cerebral cortex，hippocampus，cerebellum，thalamus and brain stem were separated in different period under specificity anesthetic for deer anesthesia.The activity of NOS and concentration of NO were measured using colorimetry，and cGMP was determined by Elisa.The results showed that the NOS activity was significantly decreased(P<0.05 orP<0.01)，the NO contents were significantly decreased(P<0.01)，and the concentration of cGMP were also obviously decreased(P<0.05 orP<0.01)in all encephalic regions in the anesthesia group as compared with control group.These results indicated that the QTN inhibited NOS activity，and blocked NO/cGMP signal conduction suggesting that effects on NO/cGMP signal transduction may be the important mechanism of general anesthesia.

QIANG TONG NING ； NOS ； NO/cGMP ； signal pathway

FU Lian-jun

2015-12-02

國家自然科學基金項目(31302150)；吉林省科技廳發展計劃項目(20140204062NY)；吉林省教育廳“十二五”科學技術項目(吉教科合字2014379)；吉林農業科技學院種子基金項目(吉農院合字2013905)

尹柏雙(1978-)，男，副教授，博士，研究方向為麻醉與鎮痛研究，E-mail：ybs3421@126.com

付連軍，E-mail：fulianjun1968@163.com

S853.74

A

0529-6005(2016)10-0099-03