氯胺酮與咪達唑侖對巴馬豬腦組織cAMP信號通路的影響

陳 蕊 ， 師銘咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 張 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于東旭 ， 魏成威 ， 高 利

(東北農業大學動物醫學學院外科教研室 ， 黑龍江哈爾濱150030)

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氯胺酮與咪達唑侖對巴馬豬腦組織cAMP信號通路的影響

陳 蕊 ， 師銘咸 ， 郭 岑 ， 曹馨方 ， 張 宇，周 彤 ， 李欣然 ， 于東旭 ， 魏成威 ， 高 利

(東北農業大學動物醫學學院外科教研室 ， 黑龍江哈爾濱150030)

為探討氯胺酮與咪達唑侖對巴馬豬中樞神經系統cAMP信號通路的影響及影響情況，研究其中樞作用機制，試驗將35頭健康巴馬豬隨機分為對照組、麻醉誘導期、麻醉期和蘇醒期四組，在每一期處死取腦組織，用ELISA法分別測定大腦皮質、小腦、丘腦、海馬和腦干內cAMP含量。結果：氯胺酮和咪達唑侖分別能夠一定程度的降低大腦皮質和小腦中cAMP含量。表明：氯胺酮、咪達唑侖的作用可能通過中樞神經系統cAMP信號通路產生作用，為今后進一步研究提供依據。

氯胺酮 ； 咪達唑侖 ； 巴馬豬 ； 腦區 ； cAMP信號通路

AC/cAMP/PKA信號通路是神經系統興奮過程中的一條重要通路。環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)是細胞內重要的第二信使，其含量變化受腺苷酸環化酶(AC)和磷酸二酯酶(PDE)活力的雙重調節[1]，所以cAMP 在AC/cAMP/PKA信號通路中具有重要地位。

氯胺酮、咪達唑侖是動物臨床常用麻醉藥物，研究其麻醉中樞機制是指導臨床用藥的關鍵，但它對中樞cAMP 信號通路的影響目前報道較少，且不同藥物對機體cAMP通路影響的報道存在巨大差異，所以，本試驗擬研究氯胺酮與咪達唑侖對各腦區cAMP信號通路的影響，探討其中樞作用機制，為今后該麻醉藥的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與方法 鹽酸氯胺酮注射液：西安漢豐藥業有限責任公司，批號：H20054748；咪達唑侖注射液：宜昌人福藥業有限責任公司，批號：H20067040；Tris-Hcl 試劑、蔗糖和乙二胺四乙酸(EDTA)，分析純，購自上海北諾生物科技有限公司；豬cAMP測定試劑盒：中國卡爾文生物科技有限公司，批號：20120302A。

1.2 試驗動物 臨床健康的廣西巴馬小型豬35頭，7～8月齡，雌雄兼有，體重32.2±4.3 kg，由東北農業大學外科教研室從三元豬場購入。

1.3 試驗動物分組 隨機取5頭為生理鹽水對照組，其余為試驗組。生理鹽水對照組內肌肉注射生理鹽水(10 mL)，試驗組分為氯胺酮組和咪達唑侖組，每組15頭。分別肌肉注射等體積的生理鹽水及氯胺酮(0.07 mL/kg 體重)、咪達唑侖(0.2 mL/kg)。試驗動物分別在麻醉誘導期(T1 時期=15 min)、麻醉期(T2時期=45 min)和蘇醒期(T3時期=75 min)各時期宰殺5頭，采集樣本。

時間點選取：對照組和試驗組巴馬豬的一般臨床指標(T、RR和HP)和循環系統指標(DBP、MAP、SpO2、SBP 和ECG)收集和比較，以及對麻醉組中巴馬豬麻醉后一系列生物反射活動和巴馬豬行為學變化出現的時間進行記錄，并結合試驗動物麻醉后行為學變化分組標準進行分析，得出小型豬給藥后平穩的進入麻醉(T1時期)的時間為23.5±6.5 min，進入深度麻醉(T2時期)的時間為63.3±6.4 min，蘇醒期(T3時期)的時間為72.1±4.3 min。所以我們選定T1時期(麻醉誘導期)中的15 min、T2時期(麻醉期)中的45 min和T3時期(蘇醒期)中的75 min三個時間點，對氯胺酮和咪達唑侖的中樞作用機制開展研究。

1.4 腦組織樣品測定各組巴馬豬處死后，用電動石膏鋸沿巴馬豬額骨中縫，自鼻骨至枕髁之間鋸開后，使用拉鉤牽拉兩側鼻骨斷端，致使顱腔開放，隨即取出全部腦組織，用滅菌后的4 ℃生理鹽水沖洗腦組織上殘留的血跡，并在生理鹽水冰板上迅速分離出大腦皮質、小腦、丘腦、海馬和腦干后，稱重，將預冷的0.32 mol/L的蔗糖緩沖溶液(含0.32 mol/L蔗糖、1 mmol/L Na2HPO4、1 mmol/L EDTA，10 mmol/L Tris-HCl，pH值7.4)按1∶10(W/V)加入到勻漿器中，將組織放入勻漿器中，隨后在冰水浴條件下進行充分的研磨。將所得勻漿液移至離心管中，在4 ℃條件下，3 000 r/min離心10 min，收集上清液，采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定標本中cAMP含量。

2 結果

2.1 氯胺酮對巴馬豬不同腦區cAMP含量的影響

如表1所示，在氯胺酮麻醉過程中，小腦中cAMP含量性在麻醉誘導期時較對照組顯著降低；在麻醉期，與對照組相比，cAMP含量在大腦皮質、海馬和丘腦中均有不同程度的升高，其中丘腦和海馬升高顯著，腦干和小腦中cAMP含量則呈相反的趨勢變化，其中小腦的cAMP含量顯著降低；在蘇醒期，小腦中的cAMP含量仍較對照組顯著降低，而其他各個腦區中cAMP含量均恢復到正常水平。在氯胺酮麻醉過程中，大腦皮質和腦干中cAMP含量未呈明顯的變化趨勢。

表1 氯胺酮麻醉對巴馬豬不同腦區cAMP含量的影響 (U：pmol/mL，n=5)

a**：與對照組比較P<0.01，差異極顯著；*：與對照組比較P<0.05，差異顯著；b：與麻醉期組比較P<0.05，差異顯著，下表同

2.2 咪達唑侖對巴馬豬不同腦區cAMP含量的影響 如表2所示，在咪達唑侖麻醉過程中，麻醉誘導期的巴馬豬各個腦區中cAMP含量均呈升高趨勢，其中海馬較對照組升高顯著；在深麻醉期中，海馬中cAMP含量較對照組仍升高顯著；在蘇醒期中，與對照組相比大腦皮質和小腦中cAMP含量呈顯著降低，而其他各腦區cAMP含量均恢復至正常水平，在咪達唑侖麻醉過程中，腦干中cAMP含量未呈明顯的變化趨勢。

3 討論

當觸發機體的某些神經細胞后，發生興奮性，促使神經末梢突觸前部釋放神經遞質，作用于突觸后部的受體，通過AC/cAMP/PKA信號通路的一系列信號傳遞和轉導作用，影響神經系統的興奮性。在AC/cAMP/PKA信號通路中，作為細胞內重要的第二信使的cAMP可介導多種細胞內激素、神經遞質及其他信號分子[2]，也可以影響相應蛋白激酶產生系列雙向調節作用[3]。cAMP對細胞的調節作用主要是通過激活cAMP依賴性蛋白激酶A(cAMP dependentprotein kinase，PKA)來實現的，cAMP還可以通過PKA磷酸化下游的CREB發揮作用[4]，與此同時，生成的cAMP可被PDE快速水解并生成5、-AMP，致使cAMP失去生理活性[5]。PKA是依賴于cAMP的絲/蘇氨酸蛋白激酶，全酶由兩個催化亞基C和兩個調節亞基R組成。調節亞基上有cAMP結合位點，當兩個調節亞基與cAMP結合后，催化亞基呈游離狀態而具有活性[6]。

表2 咪達唑侖麻醉對巴馬豬不同腦區cAMP含量的影響 (U：pmol/mL，n=5)

氯胺酮(Ketamine)作為一種自1970 年開始在臨床上應用的靜脈麻醉藥，是苯環己哌啶(Phencyclidine，PCP)衍生物，它能選擇性地阻斷痛覺沖動向丘腦新皮層系統的傳導，興奮腦干及邊緣系統，引起意識模糊、短暫性記憶缺失，但意識并未完全消失，常有夢幻、肌張力增加、血壓升高等，此狀態又稱為分離麻醉[7]。咪達唑侖(Midazolam)為水溶性苯二氮卓類藥，具有抗焦慮、催眠、抗驚厥、肌肉松弛和順行性遺忘作用，以及消除半衰期短、起效快、無明顯蓄積作用及治療指數高等特點，是理想的靜脈麻醉藥[8]。研究表明，多數全麻藥能明顯改變大腦皮層和小腦等腦區cAMP的含量。張志龍等研究表明，氯胺酮能夠明顯的增加大鼠不同腦區的cAMP 的含量[9]，丁海雷等研究表明，依托咪酯能夠使大鼠各腦區cAMP含量升高[10]，許多靜脈麻醉藥的作用機制可能涉及cAMP信號通路，其環節可能與GABA及其復合體含量、AC等多方面調節相關。

本試驗結果表明，氯胺酮對小腦內cAMP含量有顯著抑制作用，而丘腦和海馬內cAMP含量呈顯著升高的趨勢；咪達唑侖可使海馬和丘腦內cAMP含量升高。這一結果表明，巴馬豬不同腦區的cAMP信號傳導系統可能參與了氯胺酮等麻醉藥麻醉分子機理的調控。至于氯胺酮使小腦內cAMP含量降低，可能是由于藥物劑量不同以及動物種屬不同所致，這需作出進一步研究來給予解答。

氯胺酮等麻醉藥對巴馬豬大腦、海馬、丘腦、小腦和腦干內cAMP含量有明顯的影響作用，表明cAMP信號傳導系統是氯胺酮等麻醉藥產生全身麻醉作用的重要機制之一。

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Effects of Ketamine and Midazolam on cAMP signaling pathway in brain tissue in miniature pigs

CHEN Rui ， SHI Ming-xian ， GUO Cen ， CAO Xin-fang ， ZHANG Yu，ZHOU Tong ， LI Xin-ran ， YU Dong-xu ， WEI Cheng-wei ， GAO Li

(Institute of Animal Medicine Surgery Teaching and Research Section，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To explore the effect of ketamine and midazolam on the central nervous system cAMP signaling pathway，35 healthy experimental Bama pigs were randomly divided into four groups：control group，anesthesia inducement period，stage of narcosis and revive period.In each period,the pigs were euthanized for brain samples，cAMP levels in cerebral cortex，cerebellum，thalamus，hippocampus and brainstem were measured by ELISA.Our results showed that ketamine and midazolam were able to reduce cAMP content to a certain level in cerebral cortex and cerebellum independently.Our data indicate that ketamine and midazolam might act on central nervous system cAMP signaling pathway.

Ketamine ； Midazolam ； Bama pigs ； Brain regions ； cAMP signaling pathways

GAO Li

2015-11-12

國家自然科學基金(31372491，31572580)

陳蕊(1990-)，女，碩士，從事臨床獸醫工作，E-mail：563928610@qq.com

高利，E-mail：gaoli43450@163.com

S859.7

A

0529-6005(2016)10-0093-03