幾種消毒劑對牛型結核分枝桿菌的殺菌效果試驗

郭建華 ， 包美娟 ， 王 娟 ， 李前勇 ， 曹 政

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

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幾種消毒劑對牛型結核分枝桿菌的殺菌效果試驗

郭建華1， 包美娟1， 王 娟1， 李前勇1， 曹 政2

(1.西南大學榮昌校區動物醫學系 ， 重慶榮昌402460 ； 2.重慶澳龍生物制品有限公司 ， 重慶榮昌402460)

為了研究復合酚、氫氧化鈉、聚維酮碘等消毒劑在不同濃度、不同作用時間對牛型結核分枝桿菌的殺菌效果；本研究以濃度為20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%的消毒劑分別對牛型結核桿菌進行處理，作用時間分別為10、20、30、60 min、1、2、6、12 h；結果顯示，濃度在0.2%及以上的復合酚在12 h內可殺滅牛型結核分枝桿菌，1%以上聚維酮碘處理6 h以上可殺滅牛型結核分枝桿菌，而所有試驗濃度的氫氧化鈉對牛型結核分枝桿菌沒有殺滅作用；本研究結果表明，復合酚和聚維酮碘可用于環境的牛型結核分枝桿菌的凈化。

消毒劑 ； 牛型結核分枝桿菌 ； 殺菌

結核病是由分支桿菌屬結核桿菌引起的一種人獸共患慢性消耗性傳染病。在家畜中，牛最易感染牛型結核分枝桿菌而發生結核病，特別是奶牛，其次是水牛和黃牛，不但造成經濟損失，而且危害人畜健康。結核病是全球重要的公共衛生問題，在一些發達國家如德國、澳大利亞等國的人結核病患者中，約0.2%～0.3%是由牛型結核分枝桿菌引起的，而在埃塞俄比亞、尼日利亞、坦桑尼亞等不發達國家中，這個比例高達 17.0%～26.1%[1-2]，由此可見，控制牛結核病不僅對于動物疫病防治，還是對人健康，都具有重大的公共衛生學意義。

由于動物用藥的各種限制，合理、科學的消毒在動物疫病防控中顯得非常重要性。消毒可有效地殺滅養殖場、交通工具等環境中病原微生物，清除傳染源，達到預防疾病，保證畜禽健康生長的目的，同時也可以保護人的健康。畜禽業目前應用較多的是各種化學消毒劑，主要分為鹵素類(氯制劑、碘制劑、溴制劑)、醛類、酚類、醇類、氧化劑類、表面活性劑類、酸堿類等。已有研究者在消毒劑對結核分枝桿菌的殺滅效果方面做了研究[3-8]，但對牛型結核分枝桿菌的消毒效果，未見報道。

本試驗以牛型結核分支桿菌為研究對象，研究不同濃度的聚維酮碘、復合酚以及氫氧化鈉溶液，在不同的作用時間對牛型結核桿菌的殺滅作用，旨在研究這幾種消毒劑的殺菌效果濃度和作用時間，為牧場、動物醫院等環境的凈化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 試驗菌株牛型結核分枝桿菌由國家獸醫微生物菌種保藏中心提供。

1.2 培養基 改良羅氏培養基的制備參照中國防癆協會制定的“結核病診斷細菌學檢驗規程”[9]。稱取磷酸二氫鉀 14 g，枸櫞酸鎂 0.6 g，硫酸鎂0.24 g，谷氨酸鈉7.2 g，以及量取丙三醇12 mL，溶解于大約600 mL水中，加馬鈴薯淀粉30g，混勻，沸水浴煮1 h成糊狀，待冷卻后加入2%無菌的孔雀綠水溶液20 mL中，用消毒紗布過濾的新鮮雞卵液定容至1 000 mL，混勻后分裝于無菌試管內擺成斜面，90 ℃蒸汽加熱90 min滅菌。冷卻后隨機取數支于37 ℃培養箱中進行無菌試驗24 h，確定無菌后4 ℃冰箱保存備用。

2 方法

2.1 麥氏標準管的配制 本試驗所需為0.1和 0.5麥氏單位。取0.1 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.9 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.1麥氏單位。取0.5 mL濃度為1.175%BaCl2溶液與99.5 mL濃度為1%H2SO4溶液混合均勻即為0.5麥氏單位。

2.2 消毒液的配制 將氫氧化鈉、聚維酮碘、復合酚等依據衛生部衛生法制與監督司2002年編制的《消毒技術規范》按照其主要的消毒成分進行不同濃度稀釋[10]，分別用無菌生理鹽水配制成20%、10%、5%、2%、1%、0.5%、0.2%、0.1%、0.01%消毒液。

2.3 菌株的活化、增殖、抗酸染色 取凍干菌種管，在無菌操作下打開，用無菌吸管加入0.3 mL～0.5 mL稀釋液(滅菌的含0.5% Tween-80 的生理鹽水)于安瓿瓶內，使凍干菌種溶解呈懸浮液，輕柔吹吸數次，使菌種融化分散。混勻后，將少許菌種懸浮液接入改良羅氏斜面培養基中，置于37 ℃培養。接種后第3、7、14、21、30天分別觀察菌落生長及污染情況。用接種環取第1代培養物，接種于斜面培養基上，于37 ℃培養直至長出典型培養物。挑取第2 代培養物中典型菌落，接種于斜面培養基，于37 ℃培養15 d以上，即為第3代培養物。

將培養物均勻涂抹于載玻片上，用齊-尼二氏染色法染色，在光學顯微鏡下觀察，如可見紅色、抗酸性、短桿狀、微彎、團狀聚集菌體，偶見分枝即為牛型結核分枝桿菌。

2.4 菌懸液的制備與接種 取菌種第3代～5代的改良羅氏培養基斜面新鮮培養物(72 h內)，用5.0 mL吸管吸取3.0 mL～5.0 mL稀釋液加入斜面試管內，反復吹吸，洗下菌苔。隨后，用5.0 mL吸管將洗液移至另一無菌試管中，用混合器混合5min，以使細菌懸浮均勻，用稀釋液將菌懸液稀釋至0.5麥氏單位備用。

用2.2.2配制好的9個不同濃度的消毒液分別將0.5麥氏單位的結核分枝桿菌稀釋為0.1麥氏單位，稀釋的同時開始計時，分別在稀釋5、10、15、20、25、30、45、60、120 min、6、12、18、24 h各時刻加入生理鹽水，以3 000 r/min離心20 min，收集沉淀，棄上清，反復洗滌2次后，用生理鹽水配制成0.1麥氏單位菌液，取50 μL菌液接種在準備好的培養基上，試驗設重復3個。37 ℃培養箱培養14 d后，分別觀察結核分枝桿菌的生長情況。

2.5 結果判定 14 d后開始觀察，若培養基有黃色菌落的生長，說明該消毒劑對結核桿菌沒有殺滅作用，記為“+”；若沒有長，說明該消毒劑對結核桿菌有殺滅作用，記為“-”。

3 結果

3.1 復合酚的殺菌試驗結果 各濃度復合酚不同時間處理殺滅牛型結核桿菌試驗結果如表1所示。從表1中可以看出，0.1%及以下濃度的復合酚溶液對結核桿菌沒有殺滅效果。而0.2%濃度及以上的復合酚溶液在與結核桿菌作用12 h后能將其殺滅；0.5%濃度的復合酚溶液在與結核桿菌作用60 min后能殺滅結核桿菌；濃度在1%及以上的復合酚溶液與結核桿菌作用10 min后就會有殺菌效果。而0.5%以下的濃度的復合酚處理30 min以內的菌株中，可以看見呈顆粒狀或菜花狀的黃色菌落。

3.2 聚維酮碘的殺菌試驗結果 聚維酮碘的殺菌試驗結果見表2。表2顯示結果為：10 min至12 h，5%及以上濃度都沒有長出結核桿菌，2%濃度的則是在殺菌試驗處理2 h及其以上不長出結核桿菌，2 h以內均長出結核桿菌；1%濃度在殺菌試驗進行6 h后不長出結核桿菌；0.5%以下濃度在殺菌試驗進行的每個時間段后均長出結核桿菌。

表1 復合酚對牛型結核分枝桿菌的殺菌效果

+：有菌落生長；-：沒有菌落的生長，下表同

表2 聚維酮碘對牛型結核分枝桿菌的殺菌效果

3.3 氫氧化鈉的試驗結果 接種14 d后開始觀察試驗結果并記錄結果，發現各濃度氫氧化鈉處理結核桿菌沒有殺滅效果。

4 討論

結核桿菌細胞壁的脂類多為磷脂、蠟質和脂肪酸，它們與細胞壁的蛋白質和多糖結合，使細胞壁的密度增大，增強細胞壁的保護效果，防止多種殺菌藥液滲入，導致結核桿菌對化學消毒劑的抵抗力較其他細菌強，從而消毒難度更大[3]。

本試驗中表明，復合酚對牛型結核分支桿菌的殺滅效果較好，只是濃度較低且作用時間較短的條件下復合酚溶液對結核桿菌沒有殺滅作用。正常情況下濃度在0.2%及以上的復合酚在12 h內能將結核桿菌殺滅，而濃度為1%及以上的復合酚在10 min后就可殺滅結核桿菌。

聚維酮碘是碘和1-乙烯基-2-吡咯烷酮結合形成的絡合物，是中效消毒劑，通過接觸細菌細胞，釋放游離碘直接鹵化鹵體蛋白質，產生沉淀，破壞細胞膜，從而達到殺滅細菌的作用。在本試驗中，2%聚維酮碘處理2 h以上才能徹底殺死牛型結核分枝桿菌，而要在較短時間殺滅菌株，需要5%以上的濃度。

本試驗的氫氧化鈉各濃度中，均未能殺死試驗菌株，說明牛型結核分枝桿菌的耐堿性極強。在“結核病診斷細菌學檢驗規程”中，規定在分離牛型結核分枝桿菌的試驗中，常用2%氫氧化鈉處理樣品來除去雜菌[9]，我們發現20%氫氧化鈉處理12 h仍然不能有效殺死牛型結核分枝桿菌。

從本試驗的結果來看，消毒劑的作用效果不但取決于消毒劑的濃度，也跟作用時間有關，我們在實踐中不但要保證消毒劑的濃度，也要確保消毒時間充足。這點對于養殖場人員進出的消毒間尤為重要。

當然消毒劑具有一定的腐蝕性，特別是高濃度的消毒液，對人的皮膚、黏膜、口腔、眼等有損害[3]，對人表面消毒時，要在消毒劑濃度和作用時間之間做出選擇，盡量選擇低濃度并且作用時間短的、對人損傷小的消毒劑。

[1] Muller B，Durr S，Alonsi S，etal.Zoonotic Mycobacterium bovisinduced tuberculosis in humans[J].Emerging Infectious Diseases，2013，19(6)：899-908.

[2] World Health Organization：Global tuberculosis report 2014[M].WHO/HTM/TB/2014.08.Geneva，Switzerland：WHO；2014.

[3] 孫秀俠，許金云，李家婭.“84”消毒液對結核桿菌殺滅效果研究[J].中華醫院感染學雜志，2000，10(3)：206-207.

[4] 楊修軍，王艷秋，董麗麗，等.含氯復方消毒劑殺滅結核桿菌效果的試驗觀察[J].中國消毒學雜志，2001，18(2)：119-120.

[5] 孫巍，徐燕，談智，等.碘伏對3株分支桿菌標準菌株殺滅效果的研究[J].現代預防醫學，2012，39(16)：4223-4225.

[6] 邱梅，陳杖榴，郝智慧，等.國內外獸用消毒劑的研究現狀與發展趨勢[J].中國獸藥雜志，2011，45(6)：43-47.

[7] 夏勇，魏蘭芬，高筱萍，等.聚維酮碘消毒劑毒性的試驗研究[J].中國消毒學雜志，2005，22(3)：263-267.

[8] 程萍，陳月，蔣紅梅.三種常用消毒液對結核分支桿菌殺滅效果的對比[J].貴陽醫學院學報，2005，30(5)：462-463.

[9] 中國防癆協會.結核病診斷細菌學檢驗規程[J].中國防癆雜志，1996，18(1)：28-31.

[10] 衛生部衛生法制與監督司.消毒技術規范(2002年版)[S].北京：中華人民共和國衛生部，2002.

Study on the Germicidal Efficacy of Several Disinfectant onMycobacteriumBovis

GUO Jian-hua1， BAO Mei-juan1， WANG Juan1， LI Qian-yong1， CAO Zheng2

(1.Department of Veterinary Medicine，Southwest University，Chongqing 402460，China；2.Chongqing Auleon Biologicals Company Limited，Chongqing 402460，China)

In this study,we investigated the germicidal efficacy of compound phenol，sodium hydroxide and povidone-iodine onMycobacteriumbovisunder various concentration and incubation time.The isolates cultures were incubated with different concentration of the disinfectant(with the concentrations 20%，10%，5%，2%，1%，0.5%，0.2%，0.1% and 0.01% respectively).The incubation time were 10，20，30，60 min，1，2，6 h and 12 h respectively.The results showed that 0.2% Compound phenolic and above sterilized theMycobacteriumboviswith 12h incubation.1% povidone-iodine and above sterilized theMycobacteriumboviswith incubation time at least 6 h.However even 20% sodium hydroxide had no role in killingMycobacteriumboviswith 12 h.The results showed that compound phenolic and povidone-iodine could be used as disinfectant to purify the environment forMycobacteriumbovis.

Disinfectant ；Mycobacteriumbovis； Germicidal efficacy

CAO Zheng

2015-07-14

西南大學科研基金資助(08BSr04)

郭建華(1977-)，男，副教授，博士，從事微生物資源開發與分子生物學研究工作，E-mail：guo0619@swu.edu.cn

曹政，E-mail：maodenghu@163.com

R 187.1

A

0529-6005(2016)10-0074-03