中藥制劑對人工感染雞大腸桿菌病療效的研究

林 洋 ， 劉 艷 ， 夏圣榮 ， 曹艷子 ， 單春喬 ， 嚴秀梅 ， 江國托

(1.大連三儀動物藥品有限公司 ， 遼寧大連116036 ； 2.江蘇省金湖縣動物疫病預防控制中心 ， 江蘇淮安211600)

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中藥制劑對人工感染雞大腸桿菌病療效的研究

林 洋1， 劉 艷1， 夏圣榮2， 曹艷子1， 單春喬1， 嚴秀梅1， 江國托1

(1.大連三儀動物藥品有限公司 ， 遼寧大連116036 ； 2.江蘇省金湖縣動物疫病預防控制中心 ， 江蘇淮安211600)

為了考察中藥制劑對人工感染雞大腸桿菌病的治療效果。以大腸桿菌標準菌株O78、O1、O2三種混合大腸桿菌菌液肌肉注射感染15 日齡海藍褐蛋公雞，之后口服不同劑量的中藥制劑與氟苯尼考粉，觀察試驗雞的臨床癥狀、病理變化、病變發生率等，最終統計出試驗雞的死亡率和治愈率。采用Duncan 法多重比較，結果各試驗組雞只死亡率均與感染對照組差異顯著(P<0.05)，而試驗組之間差異不顯著(P>0.05)，中藥高劑量組對感染雞只治愈率與感染對照組雞只自愈率差異顯著(P<0.05)，且近似于氟苯尼考粉組。因此，中藥制劑可以作為有效控制和治療雞大腸桿菌病的途徑之一。

大腸桿菌 ； 中藥 ； 藜蒿 ； 抑菌作用；

大腸桿菌是獸醫臨床感染中最常見致病菌之一，能夠引起局部或全身性感染的疾病，如大腸桿菌敗血癥、氣囊炎、關節炎、腫頭綜合征、輸卵管炎、腹膜炎、全眼球炎及臍炎等。大腸桿菌病是一種條件性疾病，養殖場飼養環境污染、通風不良、飼養密度大、濫用抗生素等因素易造成大面積發病，尤其是雛雞感染后發病率和死亡率較高，常給養殖戶帶來較大經濟損失。

大腸桿菌病之所以廣泛流行，正是由于大腸桿菌耐藥機制不斷變化，耐藥譜不斷擴大，耐藥水平不斷提高，從而影響了獸醫臨床對大腸桿菌感染的治療效果。尤其是大腸桿菌的耐藥性可能通過畜禽產品以及環境等途徑造成交叉傳播，對人類的生命健康構成威脅。目前，大腸桿菌對抗生素的耐藥性問題，己在世界范圍內引起重視。因此，設法尋求抑制大腸桿菌的耐藥性迫在眉睫[1-2]。

本試驗根據大腸桿菌的發病特點和中藥配伍中“君臣佐使”的藥理作用，制備一種抑制大腸桿菌的中藥制劑，對人工感染大腸桿菌的蛋雞進行治療效果研究，以期為防治雞大腸桿菌病篩選出有效方劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 中藥：本試驗選用黃芩、連翹、葛根和甘草4 味中藥，購自白云山藥房。野生藜蒿采自江西省鄱陽湖，曬干后備用。氟苯尼考粉(10%)由大連三儀動物藥品有限公司提供，按說明書使用。

試驗菌株與培養基：供試大腸桿菌標準菌株O78、O1、O2，購自中國微生物菌種保藏中心并由大連三儀動物藥品有限公司保存。供試培養基均按常規法制備，滅菌后置4 ℃冰箱保存備用。

試驗動物：350 只健康海藍褐蛋公雞，購自韓偉雞場。未免疫大腸桿菌疫苗，試驗期間采用無抗生素飼料，自由采食與飲水，15 日齡開始試驗，16日齡進行給藥，試驗周期25 d。

1.2 試驗方法1.2.1 中藥制劑 將黃芩、連翹、葛根、甘草4 味中藥和野生藜蒿，烘干后各稱取500 g，加水10 L，浸泡30 min 后煎煮，煮沸后文火煎60 min，過濾，藥渣加水5 L 煮沸60 min，過濾藥液，合并兩次藥液，濾液減壓濃縮至2.5 L，即藥液中生藥含量為1 g/mL，滅菌備用。

1.2.2 常用培養基和溶液的配制 營養瓊脂固體和液體培養基、0.9%生理鹽水的配制均按常規方法配制，氟苯尼考粉(10%)用無菌水配制成氟苯尼考粉(0.25 g/mL)的溶液，備用。

1.2.3 致病大腸桿菌菌液制備及計數 將3 種大腸桿菌菌株接種營養瓊脂液體培養基，置37 ℃恒溫培養箱培養18 h，菌液經稀釋后涂布于營養瓊脂平板，置37 ℃恒溫培養箱培養24 h 后計數，三種大腸桿菌菌液濃度均調至為5×108CFU/mL，混合后4 ℃保存備用。

1.2.4 大腸桿菌半數致死量(LD50)的測定 將30只14日齡的試驗雞平均分成6組，每組5只，分別給每只雞肌肉注射0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 大腸桿菌混合菌液，觀察72 h 內雞只死亡情況，判定該混合菌的致病力，以感染后能引起死亡率達50%～60%的菌液濃度為該株細菌的最佳攻毒劑量。根據結果確定5×108CFU/mL 混合菌液肌肉注射0.5 mL/羽。

1.2.5 試驗分組與作用方式 將300只15日齡試驗雞分為6組，見表1，每組3個平行組，每個平行組17只試驗雞。

表1 分組與給藥方式

1.2.6 藥效評價標準

1.2.6.1 體外抑菌試驗抑菌圈法：營養瓊脂培養基傾入滅菌培養皿內，放置凝固后作為底層培養基。用無菌吸管吸取大腸桿菌培養液0.1 mL，滴在平皿底層培養基上，用無菌棒將菌液涂勻，在平皿底部作好相應標記，用打孔器在營養瓊脂板上打孔、封底，用滴管分別將藥液加到孔中，150 μL/孔，每孔3 個重復，蓋上平皿蓋。然后將滴加藥液的平皿水平置恒溫箱內，37 ℃培養18～24 h，測量抑菌圈直徑。判定標準：≥19 mm 為高度敏感；14～19 mm 為中度敏感；10～14 mm 為低度敏感；≤10 mm為耐藥。

1.2.6.2 體內抗菌試驗 臨床癥狀及剖檢：致病后病雞精神狀態和特征觀察，剖檢后器官的病變和特征觀察。

病變數：凡是剖檢后出現典型大腸桿菌病癥狀，肝臟腫大、易碎、包膜增厚；脾臟腫大，心臟有心包炎，心外膜有纖維蛋白覆蓋物，氣囊渾濁，有干酪樣物質覆蓋，十二指腸有出血點，判斷為感染病變數。

死亡率：凡在試驗期間，出現大腸桿菌病癥狀并死亡，剖檢后氣囊、肝臟和心臟有典型病變特征，病料能分離出大腸桿菌的，判斷為感染死亡，計算死亡率(%)=死亡數/試驗數×100%。

治愈率：凡在試驗期間，雞經混飲給藥后，不出現拉稀等癥狀，其精神狀態、食欲、呼吸等到逐步恢復正常者均屬治愈，且剖檢后無大腸桿菌病器官典型病變特征，判斷為治愈，計算治愈率(%)=(試驗數-死亡數-病變數)/試驗數×100%。

2 試驗結果

2.1 體外抑菌試驗 如表2所示，中藥制劑、主藥及氟苯尼考粉對大腸桿菌3種血清型均有不同程度的抑制作用。

表2 中藥復方、主藥劑氟苯尼考粉體外抑菌試驗結果 (mm)

2.2 臨床癥狀及剖檢 空白對照組雞群未出現死亡和病變癥狀，健康狀態良好。而感染大腸桿菌的雞群在致病36 h 后，開始出現癥狀，病雞精神沉郁，羽毛粗亂，閉眼昏睡，食欲下降，腹瀉，張口呼吸，嚴重的臥地不起而死亡。

病死雞剖檢可見：肝臟充血、腫大、易碎，包膜增厚；脾臟腫大，心臟有心包炎、心包積液，心外膜有纖維蛋白覆蓋物，氣囊渾濁，有干酪樣物質覆蓋，十二指腸有出血點。25 日后剖檢所有試驗雞，統計試驗雞的死亡率和治愈率。試驗采用SPSS17 軟件進行分析，各平行組的均值處理采用Duncan法多重比較，結果如表3所示。

表3 動物試驗死亡率和治愈率Duncan法多重比較結果

注：肩角標字母不相同表明結果差異顯著，P<0.05，肩角標有相同字母表明結果差異不顯著，P>0.05

3 結論

從體外抑菌試驗可以看出，中藥制劑、主藥成分及氟苯尼考粉對雞源大腸桿菌標準菌株O1、O2、O78有不同程度的抑制作用，均能到達與抗生素抑菌效果相當的中敏程度。

通過體內抗菌試驗研究，空白組雞群生長狀態良好，剖檢后器官一切正常；各試驗組雞的死亡率均與感染對照組差異顯著(P<0.05)，而試驗組之間差異不顯著(P>0.05)，試驗中藥高劑量組和氟苯尼考組對感染雞的治愈率與感染對照組雞的自愈率差異顯著(P<0.05)，而兩試驗組之間差異不顯著(P>0.05)，說明中藥試驗組對雞群有不同程度保護作用，且效果近似于氟苯尼考組。

4 討論

目前，中藥廣泛應用能夠有效防治大腸桿菌病對養殖業造成的危害，說明中藥組分具有抗菌作用是不爭的事實，其作用機理尚不明確，國內外學者對中藥抗大腸桿菌的機制進行一些研究，認為：(1)中草藥通過影響致病性大腸桿菌的DNA、RNA、蛋白質的合成對其產生抑制作用[3-4]；(2)中藥通過對致病性大腸桿菌粘附性的影響[5]抑制大腸桿菌繁殖；(3)中藥提取物可以消除大腸桿菌耐藥性及耐藥質粒[6-7]，從而達到抑殺目的；(4)中藥治療傳染病不一定對細菌起直接殺滅作用，可通過扶正和祛邪兩方面來達到現代醫學所說的增強體質、防御病邪的侵襲，提高機體免疫力和抗病力的作用[8]。但在動物體內的具體的作用機制仍需大量試驗進一步研究與探索。

臨床實踐表明，中藥及中藥復方制劑對禽大腸桿菌病有較好的防治效果，其療效優于或與西藥相當[9]，并具有殘留低、治愈率高、不易產生耐藥性等特點，符合當今社會倡導綠色養殖的行業要求，有著廣闊的市場應用前景。

[1] 羅燕君，岳磊，楊大偉.我國雞源大腸桿菌耐藥現狀與對策[J].養禽與禽病防治，2006(12)：42-45.

[2] 葉裕香，韋麗金，張建華.仔豬黃白痢的綜合防治[J].中獸醫學雜志，2004(05)：16-18.

[3] 方芳，呂昭萍，王正文，等.山蒼子油抗念珠菌的敏感性及作用機理的電鏡研究[J].中華皮膚科雜志，2002，35(5)：349-351.

[4] 張文平，傅穎媛，謝小梅，等.肉桂醛抗曲霉菌作用機制研究[J].江西醫學院學報，2003，43(6)：10-14 .

[5] 韓冬，徐錫鴻.細菌黏附和中醫藥抗細菌黏附研究進展[J].遼寧中醫雜志，1994，21(12)：569-570.

[6] 康梅，許秀成.三黃片對大腸桿菌耐藥質粒消除作用的研究[J].華西藥學雜志，1999，14(5)：406-408.

[7] 鞠洪濤，韓文瑜，王世若，等.大腸桿菌耐藥基因定位及耐藥質粒消除[J].中國獸醫學報，2000，20(6)：561-562.

[8] 王桂英，武目勝，司振書.復方郁金散對雞大腸桿菌病的臨床療效觀察[J].山東畜牧獸醫，2003，24(3)：9-10.

[9] 劉守懷.中藥防治雞傳染病的臨床應用及機理研究現狀[J].中獸醫學雜志，1992(2)：45-47.

The study of Chinese Herbal Medicines effect on the Artificial Infection Chicken Colibacillosis

LIN Yang1， LIU Yan1， XIA Sheng-rong2， CAO Yang-zi1，SHAN Chun-qiao1， YAN Xiu-mei1， JIANG Guo-tuo1

(1.Dalian Sanyi Animal Pharmaceutical Co.，LTD，Dalian 116036，China ；2.Animal disease prevention and control center of Jinhu County，Huaian 211600，China)

The purpose of this study was to investigate the therapeutic effect of Chinese Herbal Medicines on Chicken Colibacillosis.The method used 3 mixed standard strains ofE.colisolution O78，O1，O2to infect 15 day-old of highland brown egg rooster by intramuscular injection,and then different doses of Chinese Herbal Medicines and florfenicol powder were given orally,And then the clinical symptoms，pathological changes，incidence of disease were observed,and mortality rate and cure rate were recorded.The results showed that，significant difference(P<0.05)was observed in mortality rate between trial group and infection control group，while there was no significant difference in the trialgroups(P>0.05)The cure rate was significant difference(P<0.05)between infected chickens and control group using high dose of Chinese herbal medicine，which was similar to florfenicol powder group.Therefore，it can be concluded that the Chinese Herbal Medicines can be used to effectively control and treat the chicken colibacillosis.

Escherichia Coli ； Chinese Herbal Medicines ； Artemisia selengnesis ； Bacteriostasis

JIANG Guo-tuo

2015-09-25

林洋(1984-)，男，工程師，碩士生，從事動物藥品研發工作，E-mail：linyang1984@yeah.net

江國托，E-mail：jgt600@sina.com

S858.31

A

0529-6005(2016)10-0049-03