新疆和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲病的 PCR 診斷

呼爾查 ， 哈西巴特 ， 李永暢 ， 席 耐 ， 巴音查汗

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052 ； 2.新疆巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心 ，新疆庫爾勒841000 ； 3.新疆巴音郭楞蒙古自治州和靜縣畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆和靜841300)

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新疆和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲病的 PCR 診斷

呼爾查1，2， 哈西巴特3， 李永暢1， 席 耐2， 巴音查汗1

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 新疆烏魯木齊830052 ； 2.新疆巴音郭楞蒙古自治州動物疾病控制與診斷中心 ，新疆庫爾勒841000 ； 3.新疆巴音郭楞蒙古自治州和靜縣畜牧獸醫(yī)站 ， 新疆和靜841300)

馬梨形蟲病是寄生于馬屬動物(馬、斑馬、驢和騾)紅細(xì)胞內(nèi)的通過蜱[2，7，11]傳播的血液原蟲病，目前已發(fā)現(xiàn)的有馬泰勒蟲[3-5]和駑巴貝斯蟲[6，9-10]兩種。被梨形蟲感染的馬屬動物發(fā)病后出現(xiàn)發(fā)熱、皮下淋巴結(jié)腫大、貧血、黃疸等主要癥狀，降低動物的勞動力，偶爾會出現(xiàn)死亡病例。該病常出現(xiàn)在3月底至5月中旬，6月至8月份散發(fā)與該地區(qū)的蜱蟲活動密切相關(guān)。在巴音郭楞蒙古自治州(簡稱巴州)主要發(fā)生在馬養(yǎng)殖較多的縣市，和靜縣[1]最為突出，焉耆馬(地方品種馬匹總稱)為其特色，因近年來焉耆馬的存欄量在逐步減少，提高焉耆馬飼養(yǎng)數(shù)量已是非常重要。馬梨形蟲病[8]的廣泛流行，給巴州馬產(chǎn)業(yè)帶來了嚴(yán)重的考驗。隨著新疆馬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，專業(yè)技術(shù)人員對該病的認(rèn)識及研究水平亦在不斷提高，正在努力掌握和探索一系列較為先進的診斷和防控技術(shù)，為預(yù)防、控制馬梨形蟲病奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 從巴州和靜縣兩個山區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)的焉耆馬養(yǎng)殖戶，共采集了68份全血樣品，同時進行血液涂片，經(jīng)甲醇固定后帶回實驗室染色。記錄馬匹年齡與性別，觀察馬匹體表是否有蜱蟲吸血，并一同采集了附著于馬匹體表的飽血、半飽血和地面未吸血的蜱蟲。

試劑：瓊脂糖、溴化乙錠，購自Sigma公司；賽百盛血液基因組DNA提取試劑盒，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL-2 000Marker、2×EsTaqMaster Mix(TaKaRa)，購自晶美有限公司。

RADIAL20 臺式高速離心機(西班牙 ORTOALRESA 公司)；DK-600A 型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DYY-III-5 型電泳儀(北京六一公司)；PCR儀(美國 Bio-Rad公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 模板DNA提取 從EDTA抗凝管采集的全血樣品取出馬匹血液，使用北京賽百盛樹脂型基因組DNA提取試劑盒，按說明書操作提取馬全血基因組DNA。

1.2.2 引物 診斷所需的馬梨形蟲引物由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院寄生蟲實驗室贈送。

1.2.3 PCR擴增體系 馬泰勒蟲(25 μL)：dNTPMixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物1 μL，模板2 μL，雙蒸水 9.5 μL 至終體積 25 μL?；靹蚝笾肞CR 擴增儀中，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 30 s，引物退火溫度為 55 ℃，退火時間30 s，72 ℃延伸 30 s，共 30 個循環(huán)后 72 ℃延伸 3 min，最后10 ℃無限時設(shè)定。

駑巴貝斯蟲(25 μL)：dNTP mixture 12.5 μL(TaKaRa)，上下游引物 1 μL，模板 2 μL，雙蒸水9.5 μL至終體積25 μL?；靹蚝笾肞CR擴增儀中，擴增程序為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，引物退火溫度為 56 ℃，退火時間 45 s，72 ℃延伸 1min，共 35 個循環(huán)后 72 ℃延伸 10 min，最后 10 ℃無限時設(shè)定。

2 試驗結(jié)果

2.1 PCR方法檢測馬梨形蟲感染情況

2.1.1 泰勒蟲病部分PCR陽性擴增結(jié)果 以馬泰勒蟲Te18S為引物的駑巴貝斯蟲特異性引物，目的片段為 512 bp，陰性、陽性對照成立，陰性樣品未出現(xiàn)DNA條帶，有10個樣品出現(xiàn)512 bp左右的擴增條帶。共 68 份樣品，10 份陽性，陽性率14.7%，見圖1。

2.1.2 馬駑巴貝斯蟲部分PCR陽性擴增結(jié)果 以BC48為引物的駑巴貝斯蟲特異性引物，目的片段為 451 bp，陰性、陽性對照成立，陰性樣品未出現(xiàn)DNA條帶，有40個樣品出現(xiàn)451 bp左右的擴增條帶。共68份樣品，40份陽性，陽性率58.8%，詳見圖2。

圖1 馬泰勒蟲Te18S靶基因PCR擴增

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) ；1～2：馬泰勒蟲擴增產(chǎn)物 ；3：陰性對照

圖2 馬駑巴貝斯蟲BC48靶基因部分陽性PCR擴增

M：DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～2：馬駑巴貝斯蟲擴增產(chǎn)物；3：陰性對照

2.1.3 混合感染情況 經(jīng)馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲診斷DNA 片段擴增，發(fā)現(xiàn)兩種梨形蟲共同感染的血液樣品有7個，感染率為10.3%。

2.1.4 馬梨形蟲感染情況分析 馬駑巴貝斯蟲及泰勒蟲PCR 總感染率分別為58.8%(40/68)和14.7%(10/68)，兩鄉(xiāng)均以駑巴貝斯蟲感染為主，A鄉(xiāng)、B 鄉(xiāng)共68 匹焉耆馬中分別有不同的混合感染情況，感染率分別為14.0%(6/43)和4.0%(1/25)，經(jīng)SPPS20.0 軟件分析，兩地區(qū)梨形蟲血涂片及PCR感染情況無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲PCR檢測結(jié)果

2.2 不同性別馬匹感染馬梨形蟲病檢查結(jié)果對不同性別放牧馬群進行馬梨形蟲病流行病學(xué)調(diào)查分析。PCR 結(jié)果表明，馬匹普遍感染駑巴貝斯蟲，且駑巴貝斯蟲感染率高于馬泰勒蟲；公馬與母馬駑巴貝斯蟲感染率分別為57.9%和60.0%，感染率最低為;公馬梨形蟲感染率均高于母馬；不同性別馬匹梨形蟲血涂片及PCR 結(jié)果。經(jīng)SPPS20.0 軟件分析，公馬與母馬梨形蟲檢出率均無顯著差異(P>0.05)，見表2。

表2 不同性別焉耆馬梨形蟲病感染情況

2.3 不同年齡馬匹感染馬梨形蟲病檢查結(jié)果

對不同年齡放牧馬群進行馬梨形蟲病流行病學(xué)調(diào)查分析，各年齡段馬匹梨形蟲均有感染；不同年齡馬匹梨形蟲血涂片及PCR 結(jié)果經(jīng)SPPS20.0軟件分析，各年齡段感染馬梨形蟲情況無顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 不同年齡段焉耆馬梨形蟲病感染情況

3 討論與小結(jié)

調(diào)查結(jié)果表明，巴州和靜縣是馬梨形蟲病的流行地區(qū)，此次試驗通過隨機抽樣被檢樣品對馬梨形蟲病采用血液涂片染色鏡檢法和聚合酶聯(lián)式反應(yīng)(PCR)檢測。傳統(tǒng)方法是血涂片法，該方法檢測的準(zhǔn)確性較差，而且?guī)x狀態(tài)感染的隱性馬匹，在多數(shù)情況下很難發(fā)現(xiàn)蟲體，只有在高熱期時蟲體檢出率較高。PCR技術(shù)是診斷該病較好的方法，本試驗通過對68 份血液樣本的PCR 檢測，馬泰勒蟲陽性樣品為10 份，其感染率為14.71%(10/68)；駑巴貝斯蟲陽性樣品為40 份，其感染率為58.82%(40/68)；顯著高于血液涂片染色鏡檢法的16.9%(35/68)。將68 頭份被檢血液涂片的檢測結(jié)果按不同地區(qū)、年齡、性別分組分別進行比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，馬巴梨形蟲感染情況在年齡段上和性別上均無明顯區(qū)別。

經(jīng)本次PCR 診斷結(jié)果分析，和靜縣部分地區(qū)散養(yǎng)戶焉耆馬梨形蟲病病原種類主要以駑巴貝斯蟲為主，以泰勒蟲為輔，且亦混合感染，筆者建議，通過與科研院校合作的方式可以解決基層工作技術(shù)、設(shè)備不足等問題，通過分子生物學(xué)早期診斷，隨時掌握地方馬匹感染馬梨形蟲病病原種類及其感染強度。該試驗數(shù)據(jù)可為地方散養(yǎng)戶馬梨形蟲病的綜合防控奠定基礎(chǔ)。

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2015-08-19

國家自然科學(xué)基金新疆聯(lián)合基金重點項目(U140-3283)

呼爾查(1986-)，男(蒙古族)，碩士生，研究方向為預(yù)防獸醫(yī)學(xué)，E-mail：mg93210@163.com

巴音查汗，E-mail：bynch@hotmail.com

S858.21

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0529-6005(2016)10-0042-02