PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立及臨床應用

宋予震 ， 董 青 ， 梁中濤 ， 霍 軍

(1.河南牧業(yè)經濟學院 ， 河南鄭州450011 ； 2.雛鷹農牧集團 ， 河南三門峽472100)

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PEDV疫苗株與野毒株RT-PCR鑒別診斷方法的建立及臨床應用

宋予震1， 董 青1， 梁中濤2， 霍 軍1

(1.河南牧業(yè)經濟學院 ， 河南鄭州450011 ； 2.雛鷹農牧集團 ， 河南三門峽472100)

根據豬流行性腹瀉病毒(PEDV)疫苗株和野毒株在ORF3基因上的差異，我們設計了一對引物用于建立PEDV疫苗株和野毒株的RT-PCR鑒別診斷方法，其中疫苗株PCR擴增產物長度為213 bp，野毒株為262 bp。特異性試驗結果表明，該引物對豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的擴增均為陰性。2014年3月至2015年4月期間利用該方法對河南省51家豬場的581份腹瀉樣本進行檢測，結果發(fā)現，PEDV總陽性率為54.9%(391/581)，其中野毒株陽性率84.9%(332/391)，疫苗株陽性率為15.1%(59/391)，說明當前腹瀉樣本中的PEDV檢出率依然較高，且在這些PEDV陽性病料中以野毒感染為主。

豬流行性腹瀉病毒 ； 鑒別診斷 ； 臨床應用

豬流行性腹瀉(PED)是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)引起的以仔豬腹瀉、嘔吐和脫水為主要癥狀的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。2010年底，豬腹瀉疫情在我國大范圍流行，給養(yǎng)殖戶帶來嚴重的經濟損失。PED的廣泛流行使得豬場大范圍高強度使用腹瀉苗進行免疫預防，目前國內主要使用的PED 疫苗既有滅活苗也有弱毒苗，但存在一次免疫后保護期短、抗體效價不高，以及母豬防疫時保定不到位等缺陷，需要多次免疫才能產生足夠的抗體。PED疫苗的高強度免疫接種以及接種過程中造成的散毒等情況對PEDV 野毒是一種免疫壓力，但同時也是激發(fā)PEDV 野毒進行基因重組、遺傳變異的刺激因素。本研究旨在建立一種可以區(qū)分PEDV 野毒株與疫苗株的RT-PCR 方法，并通過對臨床樣品進行檢測，為PEDV 的診斷提供快速、簡便、有效的方法，同時調查PEDV 在免疫壓力的情況下疫苗株與野毒株的共存情況。

1 材料與方法

1.1 毒株 豬流行性腹瀉疫苗株(CV777株)與豬流行性腹瀉野毒株(CH/ZZ/11株)以及兩個毒株的相關pMD-ORF3質粒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬傳染性胃腸炎病毒、豬輪狀病毒、豬偽狂犬病病毒均由本實驗室保存。

1.2 臨床樣本 581份腹瀉樣品(糞便或小腸組織及內容物)。

1.3 主要試劑 QIAamp Viral RNA Mini Kit，購自Qiagen公司；RNA酶抑制劑、dNTP Mix ture、反轉錄酶、隨機引物等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；2×PCR Reagent，購自天根生化科技(北京)有限公司；其他常用試劑，購自Sigma公司。

1.4 引物設計與合成 根據GenBank上的豬流行性腹瀉疫苗株以及野毒株ORF3基因序列，利用Primer Primier7.0軟件設計一對特異性引物P1和P2。上游引物P1：5′-CTTGTCTGTGGATGCTGTCCA-3′，下游引物P2：5′-GACTCAACAAAGCCTGCCAAT-3′，預期疫苗株的目的基因大小為213 bp，野毒株目的基因大小為262 bp，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 樣品處理以及病毒RNA的提取 取適量糞便病料使用PBS(0.01 mol/L，pH值7.2)10倍稀釋，小腸組織及內容物加適量PBS后研碎后制備成10%混懸液，將病料混懸液渦旋震蕩后，10 000 r/min(4 ℃)離心15 min，收集上清，按照QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書進行RNA提取，所提取的RNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 cDNA的合成和PCR 參考鼠源反轉錄酶(M-MLV)說明書合成cDNA，20 μL體系：RNase free ddH2O 11 μL，RNA模板2 μL，5×PrimeScriptBuffer 4 μL，dNTP Mix ture(10 mmol each)1 μL，隨機引物(20 pmol/μL)1μL，RNase抑制劑(40 U/μL)0.5 μL，M-MLV(200 U/μL)0.5 μL。反應條件為：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。

PCR體系為20 μL：2×PCR Reagent10 μL，cDNA1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反應條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.7 特異性試驗 分別取CSFV、PRRSV、TGEV、PoRV、PRV的cDNA或DNA為模板，以PEDV疫苗株和PEDV野毒株為陽性對照，以滅菌ddH2O作為陰性對照，PCR反應體系及條件同1.6。

1.8 敏感性試驗 測定疫苗株和野毒株的pMD-ORF3質粒濃度，調整為統(tǒng)一濃度后按1∶1體積進行混合，并使用滅菌ddH2O對質粒進行連續(xù)的10倍稀釋，使用稀釋的質粒作為模板按照1.6的PCR反應程序進行反應，以滅菌ddH2O作為陰性對照，確定本方法的敏感性。

1.9 穩(wěn)定性試驗 在不同時間，使用不同的已知PEDV陽性和陰性的病料或疫苗進行重復檢測，陰性樣本與陽性樣本各20份，檢驗本方法的重復性與穩(wěn)定性。

1.10 臨床樣本檢測 對河南省鄭州、新鄉(xiāng)、駐馬店、信陽、許昌、三門峽、周口、漯河、洛陽9個地區(qū)51家豬場進行調查采樣，2014年3月至2015年4月共采集腹瀉仔豬樣本581份，對這些病料使用本方法進行PEDV檢測，統(tǒng)計病料中PEDV疫苗株和野毒株所占的比例。

2 結果

2.1 PCR擴增條件的優(yōu)化 本研究建立的PCR方法由于采用隨機引物以及2×PCR Reagent，因此主要對退火溫度和時間、延伸時間、P1和P2引物濃度進行摸索和優(yōu)化。最終確定引物濃度為20 pmol/μL，添加劑量為1 μL，最佳PCR反應條件為：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。所建立的RT-PCR方法能擴增出疫苗株213 bp大小的片段，也能擴增出野毒株262 bp大小的片段，與預期目的基因大小一致(圖1)。

圖1 目的基因的RT-PCR擴增

M：DL-2 000 DNA Marker；1：陰性對照；2：PEDV疫苗株擴增產物；3：PEDV疫苗株和野毒株混合物擴增產物；4：PEDV野毒株擴增產物

2.2 敏感性試驗結果以滅菌ddH2O做陰性對照，用10倍稀釋的混合pMD-ORF3質粒做模板進行PCR擴增，結果表示，本方法可以檢測出20.6 pg/μL的混合pMD-ORF3質粒(兩種質粒添加到PCR反應體系中各10.3 pg)，并且該方法對兩種質粒的敏感性相當(圖2)。

圖2 RT-PCR敏感性試驗

M：DL-2 000 DNA Marker；1：121 ng；2：20.6 ng；3：2.06 ng；4：206 pg；5：20.6 pg；6：2.06 pg；7：0.206 pg；8：ddH2O

2.3 特異性試驗結果 利用本方法對CSFV、PRRSV、TGEV、PoRV、PRV的cDNA或DNA進行PCR擴增，結果對這些病毒的擴增均為陰性，表示本方法特異性良好(圖3)。

圖3 RT-PCR特異性試驗

M：DL-2 000 DNA Marker；1：陰性對照；2：PEDV疫苗株；3：PEDV野毒株；4：豬瘟病毒；5：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；6：豬傳染性胃腸炎病毒；7：豬輪狀病毒；8：豬偽狂犬病病毒

2.4 穩(wěn)定性試驗 不同時間使用本方法對20份PEDV陰性樣本、20份PEDV陽性樣本(5份疫苗株或疫苗株傳代細胞毒、15份野毒株病料樣本)重復檢測3次，3次檢測結果均一致，表示本方法重復性和穩(wěn)定性均好。

2.5 臨床樣品檢測結果 對采集的51家豬場581份腹瀉樣本使用本方法進行檢測，結果顯示，51家豬場全部為PEDV陽性場，豬場陽性率為100%，581份樣本的PEDV陽性率為54.9%(391/581)，391份PEDV陽性樣本中野毒株陽性率84.9%(332/391)，疫苗株陽性率為15.1%(59/391)二者均為陽性的樣本2份，占PEDV陽性病料的0%(2/391)。

3 討論

2010年10月份開始，PED在我國呈現暴發(fā)流行，給我國養(yǎng)豬產業(yè)帶來巨大經濟損失，我國各地市均有腹瀉疫情報道[1-2]如Sun等[3]報道，中國南方10省暴發(fā)的PED疫情導致超過100萬頭仔豬死亡。2013年美國和古巴也陸續(xù)開始流行PED[4-5]，PED的流行對生豬及相關產業(yè)的貿易交流帶來諸多不便。

ORF3基因編碼223個或224個氨基酸，是PEDV惟一的附屬基因。Wang等[6]的研究表明，ORF3能夠編碼一種離子通道蛋白，該離子通道的功能對病毒的感染性和致病性有重要影響。ParkS等[7]研究表明，ORF3基因是PEDV毒力的決定性因素之一。對GenBank中PEDV疫苗株與野毒株的ORF3基因序列進行比對分析，發(fā)現弱毒株在ORF3基因中存在連續(xù)數十個堿基的缺失，但是不同毒株之間ORF3基因的相似性在97.8%以上，周兵強[8]等對ORF3的基因進行分群后發(fā)現2010年以后國內流行的絕大多數毒株的同源性高，同屬于基因3群，疫苗株CV777株屬于基因2群。ORF3基因在疫苗株和野毒株之間的差異性以及ORF3基因的相對保守性為本研究提供良好的理論基礎。

由于RNA聚合酶缺乏矯正功能，所以RNA病毒容易發(fā)生變異和重組，自從SARS暴發(fā)后，人們開始越來越關注冠狀病毒的變異情況。基于ORF3的基因分型結果，一般認為與CV777株在同一亞群的毒株為疫苗株演化而來，為人為或者自然情況下野毒株與疫苗株發(fā)生基因重組或基因缺失導致。2010年以來，絕大多數豬場采用腹瀉疫苗進行免疫預防，相當一部分發(fā)生過PED疫情的豬場在使用腹瀉疫苗免疫的同時，使用腹瀉仔豬病料進行返飼或制備自家滅活苗，高強度的疫苗毒株與野毒株同時存在加速了PEDV的演化，同時也加速了野毒株與疫苗株之間的基因重組。

本研究中疫苗株的陽性率較李長龍等[9]建立的野毒株與疫苗株鑒別PCR方法檢測的臨床樣本中疫苗株比例略高(15/2)，除收集病料的地區(qū)不同外，推測主要原因為李長龍等收集的是2013年的腹瀉病料，本研究收集的為2014年初至2015年初的病料，隨時間推進，腹瀉樣本中疫苗株的陽性率有上升趨勢。

本次采集樣品的51家豬場中，34家為基礎母豬數大于500頭的中大型豬場，17家為基礎母豬數在100～500頭之間的小型豬場。34家中大型豬場采集的387份腹瀉病料樣品中PEDV陽性病料為299份，病料陽性率76.5%(299/391)，PEDV陽性病料中疫苗株陽性48份，占全部疫苗株病料比例的81.4%(48/59)。17家小型豬場采集的131份腹瀉病料樣品中PEDV陽性病料92份，病料陽性率23.5%(92/391)，PEDV陽性病料中疫苗株陽性11份，占全部疫苗株病料比例的18.6%(11/59)。檢測出的2份既有疫苗毒又有野毒的病料來源于1家大型豬場。結合這些豬場PED免疫情況，產生這種結果的主要原因與規(guī)模化豬場強化PED疫苗免疫有關。規(guī)模化豬場在疫苗免疫、抗PEDV抗體制備、自家苗制備、PED治療等措施方面優(yōu)于小型豬場；同時PED具有潛伏期長、周期流行性，PED疫苗具有一次免疫后效果差、需要多次加強免疫的特點。導致規(guī)模化豬場PEDV疫苗毒和流行毒共存時間長，因此規(guī)模化豬場腹瀉病料中PEDV陽性率低于小型豬場，但是疫苗株的陽性率高于小型豬場。同一病料中檢測出疫苗毒和野毒，表示兩者可同時感染。

本方法可區(qū)分PEDV疫苗株和野毒株，具有簡便、快捷、高效的特點。隨著分子診斷在規(guī)模化豬場的普及，本方法不僅可應用于科研單位進行大規(guī)模流行病學調查，還可應用于規(guī)模化豬場臨床診斷，對PEDV的免疫和強毒感染情況區(qū)分具有重要意義。

[1] 朱良強，占松鶴，何長生，等.安徽部分地區(qū)冬春仔豬腹瀉的流行病學調查與分析[J].畜牧與獸醫(yī)，2013，45(8)：36-38.

[2] 沈永恕，陳陸，皇甫和平，等.2011 年河南省豬流行性腹瀉病毒流行株的遺傳進化分析[J].中國預防獸醫(yī)學報，2011，35(8)：672-674.

[3] SUN R Q，CAI R J，CHEN Y Q，etal.Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets，China[J].Emerg Infect Dis，2012，18(1)：161-163.

[4] Chen Q，Li G，Stasko J，etal.Isolation and characterization of porcine epidemic diarrhea viruses associated with the 2013 disease outbreak among swine in the United States[J].Acta Biochimicaet Biophysica Sinica，2014，52(1)：234-243.

[5] Rodriguez P Y，Maritin L O.Several enteropathogens are circulating in suckling and newly weaned piglets suffering fron diarrhea in the province of villa clara[J].Trop Anim Health Prod，2013，45(2)：435-440.

[6] WANG K，LU W，CHEN J，etal.PEDV ORF3 encodes an ionchannl protein and regulates virus production[J].FEBS Lett，2012，586(4)：384-391.

[7] PARK S，MOON H，LUO Y，etal.Cloning and further sequence analysis of the ORF3 gene of wild and attenuated type porcine epidemic diarrhea viruses[J].Virus Genes，2008，36(1)：95-104.

[8] 周兵強，吳志明，閆若潛，等.2012-2014 年河南省豬流行性腹瀉病毒M 基因和ORF3 基因的遺傳變異分析[J].中國獸醫(yī)科學，2014，44(12)：1236-1243.

[9] 李長龍，陳建飛，張鑫，等.豬流行性腹瀉病毒野毒株/疫苗株PT-PCR 鑒別診斷方法的建立[J].中國獸醫(yī)雜志，2014，50(6)：6-8.

Development and Clinical Application of RT-PCR Differential Diagnosis Method for Vaccine Strains and Wild Strains of PEDV

SONG Yu-zhen1， DONG Qing1， LIANG Zhong-Tao2， HUO Jun1

(1.Henan University of Animal Husbandry and Economy，Zhengzhou 450011，China；.Truein Agro-Pastoral Group，Sanmenxia 472100，China)

Based on the genetic differences of ORF3 of the pig epidemic diarrhea virus(PEDV)vaccine strains and wild strains，we designed a pair of primers to establish a RT-PCR method for the differential diagnosis of PEDV vaccine strains and wild strains，of which the PCR amplification product length of the vaccine strains was 213 bp，and the wild strains was 262 bp.Specific test results showed that the amplification reactions of the primers to the pig infectious gastroenteritis virus，porcine rotavirus，swine fever virus，pig pseudo rabies virus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus were negative.We used this method to test 581 diarrhea samples from 51 pig farms of Henan province during the period of March 2014 to April 2015，and the results showed that the total positive rate of PEDV was 54.9%(391/581)，of which the positive rate of wild strains was 84.9%(332/391)，and the vaccine strains was 15.1%(59/391).All of these results indicate that the detection rate of PEDV in the current diarrhea sample is still high，and the PEDV positive samples mainly are wild strain infections.

Porcine Epizootic Diarrhea(PED) ； Differential Diagnosis ； Clinical Application

HUO Jun

2015-10-14

河南牧業(yè)經濟學院——雛鷹農牧經濟技術研發(fā)中心研究項目(CYXYXM201401)

宋予震(1979-)，男，副教授，碩士，從事預防獸醫(yī)研究工作，E-mail：zzmzsong@163.com

霍軍，E-mail：huojun@tom.com

S852.65

A

0529-6005(2016)10-0006-03