山楂PCR-SSCP反應體系與反應條件的優化

撒云俐，那冬晨

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

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山楂PCR-SSCP反應體系與反應條件的優化

撒云俐，那冬晨*

(山西師范大學生命科學學院，山西臨汾 041000)

[目的]優化山楂PCR-SSCP反應體系與反應條件。[方法]以山楂為材料，采用改良的CTAB法分步提取葉綠體DNA和核DNA，對PCR-SSCP引物進行篩選，同時進行PCR-SSCP反應體系和反應條件的優化，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測變性后的PCR擴增產物。[結果] ropB、ropL、rpoC1、ITS2、psbA-trnH 5對引物適用于山楂PCR-SSCP分析。電泳時，采用6%聚丙烯酰胺凝膠(交聯度29∶1)，4 ℃恒溫，200 V恒壓，上樣緩沖液(不含甘油)與PCR產物等量混合，98 ℃堿(1%NaOH)變性15 min，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳3～4 h可得到較好的山楂PCR-SSCP電泳圖譜。[結論]建立了山楂PCR-SSCP最優反應體系與反應條件，為山楂SSCP分析奠定基礎。

山楂；PCR-SSCP；引物；反應體系；反應條件

山楂(Crataegusspp.)隸屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科山楂屬，廣泛分布于亞洲、歐洲、中北美洲及南美洲北部，是薔薇科的一種重要植物，也是起源于我國的特產果樹[1]。目前對山楂的研究主要集中在化學成分分析、藥理、種質資源評價、育種和遺傳多樣性研究等方面。用于山楂果樹研究的分子標記技術主要有同工酶技術、RAPD、ISSR、SSR、PCR-RFLP等[2-3]。山楂種質資源的研究仍以傳統分類法為主，已無法滿足對山楂種質創新和產品更新的需求[4]。因此，應用分子生物學技術，從分子水平上探討山楂種質資源分類，為山楂種質資源保存、評價和鑒定提供依據[2]。

SSCP(Single Strand Conformation Ploymorphism)技術即DNA單鏈構象多態性技術，基本原理是DNA分子中單個堿基的變化，可造成DNA單鏈構象的巨大變化。DNA片段變性后產生sDNA，sDNA由于分子內氫鍵等非共價鍵的作用，形成二級結構，最終形成單鏈構象。相同長度不同構象sDNA的電泳速率不同，電泳后在凝膠中停留的位置不同，從而將在雙鏈水平無法檢測的DNA微小差異在單鏈水平上檢測出來[5]。SSCP技術是隨著對人類基因組的研究而發展起來的用于檢測堿基突變的技術，同時也是分子遺傳標記中最常用的方法之一[6]。

近年來，SSCP技術不斷發展和完善，與PCR技術相結合建立的PCR-SSCP技術，具有快速、簡便、靈敏度高、需要樣品少和適于大樣本篩選等優點，被廣泛應用于分子生物學的各種領域，為開展群體遺傳分析、基因分型、檢測由基因突變引起的各種遺傳病等研究提供了有力工具[6-7]。但仍存在一些缺陷，如對大于300 bp的DNA片段，隨著DNA片段長度的增加，檢測的敏感性逐漸降低[6]。同時，SSCP技術也易受上樣緩沖液、變性時間及溫度、電泳條件等因素的影響，目前在已有的報道中，SSCP分析所用的方法和試驗條件由于研究對象的不同而存在較大差別。筆者對山楂SSCP分析的前期試驗過程進行優化，以期為山楂SSCP分析奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 山楂幼嫩葉片采于山西師范大學校園內。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取。采用改良的CTAB法進行葉綠體DNA和核DNA的分步提取[8-9]，具體步驟：①采摘山楂新鮮幼嫩葉片，洗凈，吸干水分，放入預冷的研缽中，加入適量預冷的0.14 mol/L NaCl溶液，快速充分研磨成漿。②吸取植物漿液1.0 mL放入1.5 mL離心管中。③4 ℃、1 000 r/min離心20 min，取上清液于另一離心管(標記為A)中，用于葉綠體DNA的提取。沉淀標記為B，用于核DNA的提取。④A管4 ℃、3 000 r/min離心20 min，棄上清。⑤在A、B管沉淀中均加入600 μL預熱的2%CTAB溶液，迅速混勻，65 ℃水浴20 min。⑥冷卻至室溫，加入等體積的氯仿異戊醇(氯仿∶異戊醇=24∶1)，作用15 min，12 000 r/min離心10 min，取上清。重復此步驟2次。⑦加入等體積預冷的異丙醇，輕柔顛倒混勻，室溫沉淀5 min后，12 000 r/min離心8 min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，揮發乙醇至沉淀透明，用適量滅菌的去離子水溶解沉淀，4 ℃保存備用。⑧用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 引物篩選。選取psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1、ITS2、ACT2p、SOD、I1-5.8-I2作為候選引物，其序列見表1。

表1 候選引物序列

從上述8對候選引物中分別篩選出適合葉綠體DNA和核DNA進行PCR擴增的引物，同時進行PCR反應體系和反應條件的優化。每對引物對應的PCR反應體系見表2，反應條件見表3。

表2 PCR-SSCP反應體系

表3 PCR-SSCP反應條件

1.2.3 電泳檢測。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳(85 V)檢測，Gene Green核酸染料染色。

1.2.4 SSCP分析。6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的配制參考鮑思元[10]方法，30%丙烯酰胺15.0 mL、10×TBE 2.5 mL、ddH2O 32.5 mL、10%過硫酸銨750.0 μL、TEMED 75.0 μL。上樣緩沖液含有1%NaOH，不含甲酰胺，上樣緩沖液量∶PCR產物=1∶1，98 ℃變性15 min后，立即置于冰上，取8 μL上樣，電泳緩沖液為0.5×TBE。電泳溫度4 ℃，電壓為200 V，電泳完畢后進行銀染，并觀察照相。

2 結果與分析

2.1 山楂葉綠體DNA序列引物的篩選 PCR擴增產物的電泳結果表明，psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1 4對引物均可用于山楂PCR-SSCP分析。其中，rpoC1、ropL、ropB 3對引物擴增效果較好，擴增率可達100%，擴增片段長度分別約375、600、300 bp(圖1)。psbA-trnH作為引物擴增出的產物具有2條亮帶，擴增產物長度約220 bp，另一亮帶出現的原因可能是引物二聚體(圖2)。

注：M.DL 2000 DNA Marker，CK.對照，1.rpoC1，2.ropL，3.ropB。Note：M.DL 2000 DNA Marker, CK.control , 1.rpoC1, 2.ropL, 3.ropB.圖1 rpoC1、ropL和ropB引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.1 The PCR-SSCP results of rpoC1，ropL and ropB primers

2.2 山楂核DNA序列引物的篩選 PCR擴增產物的電泳結果表明，ITS2適合作為山楂核DNA的PCR-SSCP分析，擴增率達100%，擴增片段長度為550～600 bp(圖2)。I1-5.8-I2、ACT2p、SOD 3對引物不適合作為山楂核DNA PCR-SSCP擴增。其中，I1-5.8-I2和SOD經多次優化，尚未得到穩定的PCR產物。ACT2p經過多次優化，均得到多個非特異性擴增條帶。

注：M.DL 2000 DNA Marker,CK.對照,1.I1-5.8-I2,2.ITS2,3.psbA-trnH。Note：M.DL 2000 DNA Marker,CK.control,1.I1-5.8-I2,2.ITS2,3.psbA-trnH.圖2 ITS2、I1-5.8-I2和psbA-trnH引物PCR-SSCP電泳圖譜Fig.2 The PCR-SSCP results of ITS2，I1-5.8-I2 and psbA-trnH primers

2.3 聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據瓊脂糖凝膠電泳擴增結果，選擇6%的凝膠配比，對PCR擴增產物采用堿變性。恒壓200 V、4 ℃條件下電泳3～4 h。電泳結束后，蒸餾水沖洗凝膠2～3次，0.2% AgNO3染色液中染色約8 min，再用蒸餾水漂洗2～3次，顯色液(3%NaOH、1.5 mL甲醛)中顯色約20 min，至出現清晰的條帶(圖3)。

注：M.DL 2000 DNA Marker,CK.對照,1.ropB,2.ropL,3.rpoC1,4.psbA-trnH,5.ITS2。Note：M.DL 2000 DNA Marker,CK.control,1.ropB,2.ropL,3.rpoC1,4.psbA-trnH,5.ITS2。圖3 山楂PCR-SSCP電泳圖譜Fig.3 The PCR-SSCP results of Crataegus spp.

3 結論與討論

通過反復試驗從候選的8對引物中篩選出5對適于山楂葉綠體DNA(ropB、ropL、rpoC1、psbA-trnH)和核DNA(ITS2)PCR-SSCP分析的引物。在PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳時發現凝膠濃度不能過高，上樣量不能過多，否則，電泳圖譜不整齊，條帶拖尾現象較嚴重，以致于在確定片段大小時，會造成較大誤差。

該試驗對聚丙烯酰胺凝膠制備時過硫酸銨和TEMED的加入量進行了反復試驗，參考鮑思元[10]的制膠方法，配制了6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，結果放置7 h也未能凝固。張俊等[11]認為在排除凝膠成分配比錯誤的前提下，膠未凝固大多是由于過硫酸銨溶液存放時間過長引起的。鮑思元[10]認為10%的過硫酸銨必須現配現用，4 ℃冰箱保存不超過48 h。根據查閱的信息，重新配制了過硫酸銨(10%)，對凝膠成分配比進行了調整，重新制膠，結果凝膠時間不理想，約2 h后才能凝固，且所制的凝膠韌性不好，易碎，對于電泳后的染色、顯色操作不利。根據胡建斌等[12]的結果，該研究加大了10%過硫酸銨和TEMED的量，50 mL凝膠中，加入1 000 μL 10%過硫酸銨和100 μL TEMED，發現膠凝固時間明顯縮短，但所制的膠凝固不均勻，經過反復試驗，最終50 mL凝膠加入750 μL 10%過硫酸銨和75 μL TEMED，約1 h膠即可凝固，且膠的韌性較好，電泳后條帶也較整齊。該試驗對PCR擴增產物的變性采用堿變性的方法，發現其效果與余桂紅等[5]采用98%去離子甲酰胺的變性效果相差不大。

該試驗并未對影響山楂SSCP分析的各種因素進行逐一研究，僅優化了山楂PCR-SSCP的反應體系和反應條件，最后對6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備通過查閱文獻資料并經過反復試驗確定，電泳結果較好，條帶較清晰。該試驗結果對以后山楂分子生物學方面的研究以及聚丙烯酰胺凝膠的制備提供參考。參考文獻

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Optimization of PCR-SSCP Reaction System and Reaction Condition inCrataegusspp.

SA Yun-li, NA Dong-chen*

(Shanxi Normal University School of Life Science, Linfen, Shanxi 041000)

[Objective] The aim was to optimize PCR-SSCP reaction system and reaction condition. [Method] The chloroplast DNA and nuclear DNA inCrataegusspp. were step-by-step extracted by improved CTAB method, the PCR-SSCP primers were selected, and the PCR-SSCP reaction system and reaction conditions were optimizated. The PCR-SSCP productions were tested by agarose gelelectrophoresis, the denatured PCR-SSCP products were analyzed by native polyacrylamide gel. [Result]The results showed that five pairs primers (psbA-trnH、ropB、ropL、rpoC1、ITS2) of all are suitale for PCR-SSCP inCrataegusspp.. The clear electrophoretogram of PCR-SSCP inCrataegusspp. were obtained through using 6% native polyacrylamide gel. (Crosslinking degree is 29∶1) at 4 ℃ and 200 V for 3-4 h, with the volume of the loading buffer (without glycerol) was same with the volume of PCR products, denaturation temperature was 98 ℃ under 1%NaOH, denaturetion time was 15 minutes, electrophoresis buffer was 0.5×TBE.[Conclusion]The study optimize PCR-SSCP reaction system and reaction condition, in order to lay the foundation for optimization of hawthorn SSCP analysis.

Crataegusspp；PCR-SSCP；Primers；Reaction system；Reaction conditions

撒云俐(1994- )，女，山西運城人，碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。*通訊作者，副教授，碩士，從事遺傳學方面的研究。

2016-10-21

S 188

A

0517-6611(2016)33-0137-03