2011—2015年我國南方地區PEDV分子流行病學調查及S基因遺傳變異分析

李智麗，黃淑堅，馬靜云，畢英佐

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

2011—2015年我國南方地區PEDV分子流行病學調查及S基因遺傳變異分析

李智麗1，黃淑堅1，馬靜云2，畢英佐2

（1.佛山科學技術學院生命科學與工程學院，廣東 佛山 528000；2.華南農業大學動物科學學院，廣東 廣州 510642）

應用RT-PCR方法對南方地區五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內發病仔豬的小腸組織和糞便樣本進行豬流行性腹瀉病毒（PEDV）檢測，對9個豬場進行為期5年的動態監控，并對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進行測序，與GenBank中的PEDV參考序列進行比較，并繪制了系統進化樹。結果顯示，上述地區五省存在Group1和 Group 2兩種類型毒株。Group1與美國、韓國毒株較為接近，可分為G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4等4個亞群，Group 2與2004年國內分離毒株較為接近，可分為G2-1、G2-2兩個亞群。25個中國南方地區毒株集中于 G1-2 和 G1-3，而另外8株與2004年國內毒株（JS-2004-2）同屬G2-2亞群。不同類型的毒株引發的PEDV臨床表現及死亡率不同，G2-2亞群的毒株引發的PED相對緩和，死亡率較低且病程較短，而位于G1-2和G1-3亞群（尤其是G1-3）的毒株則引起大規模急性暴發，病程較長，死亡率較高。

豬流行性腹瀉病毒；動態監控；S基因；遺傳變異

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹瀉、嘔吐、脫水及哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染?。?］。PED 于1971年首次報道，并于1978年從患病豬的病料中分離出該病病原［2-3］。該病主要發生于歐洲養豬國家和東南亞養豬國家［4-5］。2008年有報道PEDV 在我國免疫豬群中流行［6］。2010年10月我國暴發PED疫情，發病范圍廣，呈急性發生，發病率為80%～100%，死亡率在50%以上［7-9］。截至目前，PEDV在中國、韓國、美國、越南、泰國、匈牙利、臺灣、加拿大、法國、美國等多個國家和地區均有報道［10-17］，PEDV給全球養豬業造成嚴重的經濟損失。

PEDV屬于尼多病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronviridae）冠狀病毒屬（Coronavims）成員。該病毒呈多形性，病毒顆粒直徑約95～190 nm，平均直徑（包括纖突）約為130 nm，表面有囊膜，囊膜上有花瓣狀纖突，長約18～23 nm［18-19］。PEDV是有囊膜、不分節段的單股正鏈RNA病毒，其基因組大小約為28 kb，5'端為含有帽子結構的非翻譯區（untranslated region，UTR），3'端為含有多聚腺苷酸尾巴（poly A）的非翻譯區，全基因組編碼至少7個開放閱讀框（open reading frames，ORFs），相鄰基因之間存在間隔序列［19-21］。S基因、E基因、M基因和N基因分別編碼病毒的結構蛋白［20-21］。其中，S 基因編碼S（spike）蛋白，由1 383個氨基酸組成，分子質量為180～220 ku，是位于病毒粒子表面的纖突糖蛋白，在病毒粒子與細胞表面受體結合后通過膜融合侵入宿主細胞，在感染宿主體內介導中和抗體產生的過程中發揮重要生物學作用［22-24］。研究表明，S基因在分析PEDV流行性毒株的遺傳變異中發揮重要作用，是序列比對中所用的重要基因［5，25］。PEDV S基因的1 495～1 914 bp含有主要的中和介導抗原決定部位，稱為COE片段，而COE片段存在大量抗原決定簇，是作為重組載體較為重要的基因，核苷酸全長為420 bp，編碼140個氨基酸，在這個序列區內所發生的點突變可能會使相關的單克隆抗體失效［26-28］。

本研究對我國南方地區五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內發病仔豬的小腸組織和糞便樣本進行PEDV檢測，對9 個暴發PEDV的豬場感染情況進行深入調查，積累了大量的流行病學材料。對此次疫情的暴發特征、病毒排毒規律及不同豬群發病規律進行分析，并對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進行測序，同時對COE片段進行生物信息學分析，構建系統進化樹將S基因與GenBank中的PEDV參考序列進行分析比較，為探討當前我國PED發生規律以及制定有效防控措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集與處理

采集我國南方地區五?。◤V東、廣西、福建、四川、江蘇）18個豬場7日齡以內發病仔豬的小腸組織和糞便樣本，并挑選9個規?；i場進行現場監控，記錄2011年1月—2015年6月的發病率、死亡率及臨床癥狀。取腸道組織或糞便組織置于預冷的無菌研磨器中，加入3 mL DMEM（含400 U/mL青霉素、200 μg/mL鏈霉素），反復研磨至糊狀，然后置于-80℃冰箱中迅速冷凍，再迅速置于37℃溫水中融化，如此反復凍融3次，10 000 g離心20 min，上清液用孔徑0.22 μm的濾器過濾除菌，糞便樣品加入1 mL DMEM直接震蕩5 min，10 000 g離心5 min，取上清液用于RT-PCR檢測。

1.2 主要試劑

RNA提取試劑、PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2、Trizol Reagent、Ex Taq、dNTP Mixture、pMD19-T Vector、dNTPs（2.5 mmol/L）、DL2000? DNA Marker和6×Loading Buffer均購自廣州瑞真生物技術有限公司（TaKaRa公司）。DH5α大腸桿菌感受態細胞自制。

1.3 引物設計及合成

參照GenBank中的PEDV毒株CV777株和Brl/87株基因序列的S基因序列，針對基因保守區利用Oligo 7.0設計引物（表1），引物由上海生工生物工程有限公司合成，擴增的目的片段大小約4 200 bp。

表1 引物名稱、序列及長度

1.4 S基因擴增

病毒RNA提取按照實驗室分子生物學常規操作進行。然后參照PrimeScript? One Step RTPCR Kit Ver.2產品說明書配制RT-PCR反應液，反應程序如下：50℃反轉錄30 min；94℃ 預變性5 min；94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸90 s，30個循環，RT-PCR產物直接用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和回收。參照Omega公司的膠純化試劑盒說明書對RT-PCR產物進行回收與純化；將回收產物按照10 μL連接反應體系于4℃下連接過夜，將連接產物5 μL轉化感受態細胞50 μL，于37℃下培養過夜。對平板中的陽性菌落進行篩選、鑒定，選擇經PCR鑒定為陽性的重組質粒，送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進行序列測定。

1.5 S基因的生物信息學分析

應用DNAStar、CLUSTALX v1.83比對，采用MegAlign software（MEGA，version5.0）基因序列軟件的 Clustal W計算方法進行序列分析，采用常用的臨位相接法（Neighbor-joining法）進行系統進化樹的構建并以Bootstrap驗證進化樹的可信度，分別對35株流行毒株S基因進行測定，并與GenBank中調出的參考序列（表2）進行比對，分析彼此間的相似性、遺傳進化關系及變異程度，并繪制系統進化樹。通過網站 http：//tools.immuneepitope.org 對S蛋白中的COE片段進行抗原位點預測；通過網站 http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/ 對COE片段進行糖基化位點預測。

2 結果與分析

2.1 PEDV感染豬場的臨床表現

對9個豬場的監控結果可知，PEDV全年均有發生（圖1），但仔豬的死亡率有所差異，2011—2012年死亡率為50%～100% ，2013年的死亡率最低，2014—2015年則有增加趨勢，死亡率為0～30%，死亡率最高發生在2011年2月，9個豬場仔豬死亡數量達到12 000頭。PEDV對懷孕母豬的影響較大而對育肥豬的影響最小，其中，懷孕母豬、哺乳母豬、保育豬和育肥豬的發病率為20%～80%，臨床表現為沮喪、食欲不振、腹瀉等，死亡率較低甚至沒有死亡（圖2）。

圖1 2011—2015年9個規?；i場仔豬死亡情況

表 2 本研究所用序列及參考序列信息

圖2 2011年9個規?；i場懷孕母豬、哺乳母豬、保育豬和育肥豬的發病情況

2.2 S基因變異分析

將35株臨床分離的PEDV的S基因測序結果上傳至GenBank，其S基因序列長度為4 152～4 161 bp，編碼 1 384～1 387個氨基酸，其中有4個毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011、CHGMB-02-2013）與疫苗株CV777相比有獨特的結構特征，在163位有1個氨基酸（N）插入，并有 58 個氨基酸變異，變異率為 4.18%；而另外的31株流行株在59～62位有4個氨基酸（QGVN），在140位有1個氨基酸（N）插入，96個氨基酸變異，變異率為6.92%。這些變異情況與美國毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013和USA-Colorado30-2013）和臺灣毒株（TWChiayi-32）一致，并且與韓國在2011年分離的流行株（CNU-091222-01 和 CNU-091222-02）的變異情況一致。

與經典毒株CV777（疫苗株）相比，流行株的COE片段核苷酸變化最大的位置位于1 586～1 617 bp和1 802～1 874 bp（氨基酸位置分別是527～539和600～625）。在PEDV流行毒株的COE片段序列中存在4個B細胞抗原表位區，分別為其推導氨基酸序列中第4～10位的PSFNDHS，第55～69位的NVTNSYGYVSKSQDS，第76～83位的QSVNDYLS以及第129～134位的GTPKP（圖3）。COE片段氨基酸序列的糖基化位點預測位于COE推導氨基酸序列的第13位與第55位，即S蛋白中的第511位與第533位中均存在兩個高度保守的糖基化位點，分別為NIT與NVT（圖4）。

圖3 COE片段B細胞抗原表位預測

圖4 S基因COE片段糖基化位點的預測

2.3 S基因遺傳進化分析

構建S基因遺傳進化樹，結果（圖5）表明，PEDV存在兩種類型毒株，分別為Group1和Group 2。Group1與美國、韓國毒株較為接近，可分為4個亞群G1-1、G1-2、G1-3 和G1-4；G1-1亞群包含7個美國流行毒株、5個臺灣流行毒株和2個中國南方地區毒株，G1-2亞群包括15個南方地區毒株，4個國內毒株及兩個美國毒株，G1-3亞群包括10個南方地區毒株和2個國內毒株，G1-4亞群包括1個韓國毒株和1個中國毒株?？梢?，G1-2亞群包含的毒株大部分是2012—2015年分離的，而G1-3 亞群則主要包含了2011年國內分離的毒株。Group 2與2004年分離的毒株較為接近，可分為G2-1、G2-2兩個亞群。其中G2-1亞群主要包含早期毒株及疫苗株，而G2-2亞群則包含了2004年國內毒株（JS-2004-2）和8株南方地區流行株。

圖5 35株中國南方地區PEDV毒株及參考序列的S基因遺傳進化樹

2.4 S基因同源性分析

35株臨床分離的PEDV的S基因之間同源性為93.0%～100%，與參考序列的同源性為92.4%～99.0%； Group1的序列之間同源性為97.5%～100%，與Group2相比同源性為93.7%～95.9%；G2-2亞群中的8個毒株與2004年國內毒株（JS-2004-2）同源性較高，而與其余27個南方地區毒株（位于G1-2和G1-3亞群）相比同源性較低、為94.8%～95.7%；G1-2和G1-2亞群的序列同源性為97.9%～98.7%。

值得關注的是，不同類型的毒株引發的PEDV臨床表現及死亡率不同，G2-2亞群的毒株引發的PED相對緩和，死亡率較低且病程較短，而位于G1-2和G1-3亞群（尤其是G1-3）的毒株則引起大規模急性暴發，病程較長，死亡率較高。

3 結論與討論

本研究對南方五省18個豬場7日齡以內發病仔豬的小腸和糞便樣本進行了PEDV檢測，對其中9個豬場進行為期5年的動態監控。結果發現PED全年均有發生，有一定規律性，但仍不明顯。 2011—2012年死亡率為50%～100%，而2014—2015年死亡率為0～30%，2013年的死亡率最低，而2014—2015年有增加趨勢。PEDV對懷孕母豬的影響較大而對育肥豬的影響最小，建議開展各階段尤其是懷孕母豬體內的PEDV抗體監控，進而為PEDV的防控提供科學指導。國外學者也認為應當采取科學措施合理管理懷孕母豬以便減少仔豬的發病率和死亡率［20］。

本研究對2011—2015年期間分離的35個PEDV流行株的S基因進行測序，其中有4個毒株（CH-SHT-12- 2011、CH-STC-12-2012、CH-HKC-08-2011 和 CH-GMB-02-2013）與疫苗株CV777相比有獨特的特征，變異率為4.18%，而另外的31株流行株變異率為6.92%，且這些變異情況與美國毒株（PC21A、IA1、MEX-104-2013 和USA-Colorado30-2013）、臺灣毒株（TW-Chiayi-32）及韓國在2011年分離的流行株（CNU-091222-01 和CNU-091222-02）一致［5，11，15，17，29-30］。

通過構建S基因遺傳進化樹發現，PEDV存在兩種類型毒株，分別為Group1和 Group 2，其中31株流行株歸于Group1，與美國、韓國毒株同源關系較為接近，具有同源性意義；CH-SHT-12-2011、CH-STC-12-2012、CHHKC-08-2011和 CH-GMB-02-2013歸于Group 2，與2004年分離毒株同源關系較為接近。且兩種類型的毒株引發的PEDV臨床病死率不同，Group1的毒株引起的PEDV呈大規模急性暴發，病程較長，死亡率較高；Group 2的毒株引發的PEDV呈緩和型暴發，死亡率相對較低且病程較短?？梢姳狙芯恐?1株毒株為世界范圍內流行株，而其余4個毒株呈地方性流行，與早期分離毒株較為接近。

我國南方地區PEDV流行毒株S蛋白中的第511位與533位中均存在兩個高度保守的糖基化位點，分別為NIT與NVT，與文獻報道一致［31］。糖基化是影響抗原的免疫原性、誘導動物機體產生保護性免疫反應的一個重要原因。對我國南方地區PEDV流行毒株COE片段B細胞抗原表位預測發現，與Chinju99株存在差異，南方地區毒株的COE片段僅有4個B細胞抗原表位區，有別于Chinju99的6個B細胞抗原表位區［26，32］。這些突變位點是否能引起毒株毒力改變仍需要進一步研究。

本研究結果揭示我國主要流行的PEDV野毒株不同于疫苗株（DRl3、CV777），可逃避目前國內外傳統的常規疫苗免疫，但我國同時又存在經典毒株，使得我國PEDV野毒株遺傳變異的復雜性更大［8-9，22-23］，加劇了臨床防控的難度。因此對PEDV的長期監控及抗體檢測需加強，并從發病原因、病原變異規律、免疫方式上進一步深入研究。

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（責任編輯 崔建勛）

Molecular epidemiological investigation of PEDV and analysis of genetic variation of S gene in South China during 2011-2015

LI Zhi-li1，HUANG Shu-jian1，MA Jing-yun2，BI Ying-zuo2
（1.School of Life Science and Engineering，Foshan Umiversity，Foshan 528231，China；2.College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China）

The study conducted a large scale molecular epidemiological investigation and five years monitoring of nine swine herds with the outbreak of diarrhea located in geographically separate regions of south China by RT-PCR. Porcine intestinal and fecal samples were collected from 18 swine farms in five provinces （Guangdong province，Guangxi province，Fujian province，Sichuan province，Jiangsu province） in south China with the piglets younger than 7 days old that showed watery diarrhea and dehydration. 35 spike （S） genes were determined to analyze the genetic diversity and epidemiological features during 2011-2015. The results showed that all PEDV strains could be divided into two groups，Group1 and Group 2. Group1 had a close relationship with the United States strains and Taiwan strains，and had four subgroups，G1-1，G1-2，G1-3 and G1-4. Group 2 felled into the same branch with the previous Chinese isolates from 2004 that had two subgroups，G2-1 and G2-2. The subgroup G1-2 and G1-3 comprised most of the strains isolated in south China while the subgroup G2-2 comprised thestrain isolated in 2004 （JS-2004-2） and eight else isolated in south China in our study. It is remarkably that clinical morbidity caused by two types of PEDV strains were quite different，strains in G2-2 caused relatively minor mild clinical manifestations，presenting a smaller mortality and shorter onset period，while strains in G1-2 and G1-3 is caused an outbreak of acute infectious diseases，showing a larger mortality and longer period especially PEDV strains in G1-3.

porcine epidemic diarrhea virus；dynamic investigation；Spike gene；genetic variation

S855.3

A

1004-874X（2016）11-0127-09

2016-07-24

國家自然科學基金（31502071）

李智麗（1983-），女，博士，講師，E-mail: pinganzhili@163.com

畢英佐（1944-），男，研究員，E-mail: yzbi@scau.edu.cn

李智麗，黃淑堅，馬靜云，等. 2011—2015年我國南方地區PEDV分子流行病學調查及S基因遺傳變異分析［J］.廣東農業科學，2016，43（11）：127-135.