基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測

王 晨，曾檢華，秦 珂，何祖勇，陳瑤生，劉小紅

（1．中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測

王 晨1，曾檢華2，秦 珂1，何祖勇1，陳瑤生1，劉小紅1

（1．中山大學生命科學學院/有害生物控制與資源利用國家重點實驗室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

廣東小耳花豬是廣東省飼養量最大的地方豬品種，農戶自繁自養過程中可能混入外來豬種血緣，實際生產中主要通過表型進行評估和選育。CYB5A基因啟動子中的突變位點可以鑒定中外豬種遺傳背景，因此可通過分子方法檢測廣東小耳花豬群體中是否混有外來豬種血緣。采用PCR擴增CYB5A基因啟動子并進行單向直接測序，將得到的基因序列進行對比以鑒定變異位點。結果顯示，32頭種豬和36頭后備母豬中均有1頭為雜合子AB型，A等位基因頻率分別為0.0152和0.0139，其余種豬和后備母豬均為中國豬種純合子BB型。經卡方檢驗，種豬和后備母豬群體在檢測位點上處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05），表明外來豬種該位點在廣東小耳花豬群體內沒有受到人工選擇。該AB型種母豬毛色表型正常，與純種廣東小耳花豬BB型公豬配種生出6頭毛色異常仔豬，其中2頭為雜合子AB型。該種母豬與杜洛克公豬配種后生出紅毛仔豬，該雜交后代的表型也驗證其混有外來豬血緣，表明分子鑒定的準確性。研究結果表明，廣東小耳花豬群體的血統基本純正，只有極少數個體混有外來豬種血緣，通過表型選擇與分子輔助育種相結合的方法可以準確、快速地提純該地方品種。

廣東小耳花豬；CYB5A基因；外來豬種；檢測

我國是世界豬肉生產與消費大國，擁有豐富的豬品種資源（共125個），約占世界豬品種總數的1/3，其中地方品種88個［1］。廣東小耳花豬是廣東省飼養量最大的地方豬種之一，主產于廣東西江以南及粵西一帶。該豬品種的頭型和體型均較小，具有頭短、耳短、頸短、身短、腳短和尾短的“六短”特征，被毛表現為黑白花，除了頭、耳、背、腰、臀部為黑色外，其余均為白色。廣東小耳花豬能適應高溫多濕的環境、耐粗飼、早熟易肥、皮薄肉嫩、肉味鮮美、母性溫順、繁殖力強，屬于典型的華南型豬種。近年來，隨著生活水平的提高，人們對豬肉品質的要求越來越高，使得地方優質種質資源得到越來越多的重視和開發利用。

微粒體細胞色素b5A（Cytochrome b5A，CYB5A）是微粒體細胞色素b5（Cytochrome b5，CYB5）的組成成員。CYB5在動植物中普遍存在，是一種重要的電子轉移血紅素蛋白。在豬上，CYB5A基因在雄烯酮合成上起著重要作用［2］，公豬的膻味主要是由于糞臭素和雄甾烯酮引起的，因此CYB5A基因的高表達量可能與公豬肉質的膻味有關［3］。研究表明，由于中國地方豬易早熟的特性，使得豬體內的膻味積累水平比歐洲豬種高［4］。眾多研究發現，CYB5A基因的編碼區不存在遺傳變異，而在ATG起始密碼子上游8 bp處存在一個G＞T的SNP，并表明該SNP與脂肪雄甾烯酮水平相關［5］，造成雄甾烯酮積累［6］。Bai等［7］發現在CYB5A基因起始密碼子的上游共有3個SNP 位點（-660 bp、-380 bp 和-69 bp），改變了轉錄因子與其結合的能力。同時，研究還發現歐洲豬種主要是單倍型A，在-660 bp、-380 bp、-69 bp 處堿基分別為G、T、C，而中國豬種主要是單倍型B，各變異位點分別為單堿基缺失、C、T。因此，該3個位點可以用來鑒定中國豬種和外來豬種不同的遺傳背景［8］。

地方豬遺傳資源是培育新品種、新品系以及保護生物多樣性的重要基礎，是養豬業今后可持續發展的重要保障。近30年來，由于大量引進外來豬種，幾乎導致了每個地方豬品種的數量急劇減少甚至消失，外來豬種與地方品種雜交亂配，造成一些品種的部分群體遺傳資源混雜。地方豬保種場內的種豬均來自于農戶的自繁自養，毛色表型是評估廣東小耳花豬血統是否純正的重要指標之一。在實際生產中，廣東小耳花豬群體中偶爾會出現毛色異常個體，通常采取表型剔除方式進行品種提純和保護。本試驗對廣東小耳花豬種豬CYB5A基因啟動子的突變位點進行檢測，在分子水平鑒定該品種的遺傳背景中是否混有外來豬種血緣，從而了解其群體資源的保護現狀，為今后該品種的保護與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

廣東小耳花豬耳組織樣品采自廣東壹號食品股份有限公司湛江豬場，其中采集了成年種豬32頭、后備母豬36頭、同一窩全同胞仔豬6頭，74份耳組織樣品用剪耳鉗采集后，用PBS溶液清洗干凈，保存在75%乙醇中，放置于-80℃冰箱中備用。

試驗主要試劑：2×Taq PCR StarMix（包含Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR buffer）購自GenStar公司，DNA Marker DS 2000購自廣州東盛生物科技有限公司，Gelview型核酸染料購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取及檢測 采用SDS法提取基因組DNA，提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA的濃度和純度，最終稀釋成100 ng/μL，放置于-20℃下保存備用。

1.2.2 引物設計與PCR擴增 參照Bai等［7］設計的引物（CYB5-F：5'AAGGAG GAGGTAAGCAATG3'，CYB5-R：5'GAGATG AGCGGAACAGAGT3'）對CYB5A基因的啟動子區域進行PCR擴增（預期產物長度為917 bp），引物由生工生物工程（廣州）股份有限公司合成。PCR擴增采用2×Taq PCR StarMix，反應體系總體積為50 μL。反應程序為94℃ 3 min；94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 2 min，33個循環；72℃ 5 min。PCR產物用1.7%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，在凝膠成像系統下觀察并拍照。

1.2.3 序列分析 PCR產物經檢測后送到廣州艾基生物技術有限公司進行純化和測序。使用Chromas 2.22軟件對測序結果進行校正，再使用MAGE 5.05軟件進行序列比對，檢測遺傳變異位點。

1.2.4 數據分析 統計廣東小耳花豬群體的基因型分布和等位基因頻率，采用卡方檢驗進行各群體內Hardy-Weinberg平衡適合性檢驗。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物檢測

對74份廣東小耳花豬DNA樣品進行PCR擴增CYB5A基因的啟動子序列，PCR產物用1.7%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，結果（圖1）顯示，PCR產物為特異性單一條帶，片段大小為917 bp，符合預期大小。

圖1 CYB5A基因啟動子PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果

圖2 -380 bp處C＞T突變

2.2 測序結果分析

由于CYB5A啟動子區域中的3個SNP 位點（-660 bp、-380 bp 和-69 bp）在同一個個體中均相同，存在明顯的連鎖情況［8］，因此本試驗僅使用反向引物CYB5-R進行單向測序。但-69 bp處T＞C靠近反向引物而無法檢測，測序結果可以鑒定-380 bp處C＞T突變和-660 bp處單堿基缺失＞G突變。運用軟件Chromas 2.22分析測序結果，發現有1頭種母豬、1頭后備母豬以及2頭仔豬在380 bp（圖2）和-660 bp（圖3）處分別出現一個雙峰和連續雙峰，表明在380 bp處存在單堿基突變，而在-660 bp處存在插入/缺失。采用外來豬種約克夏豬的序列（GenBank登錄號：KM067157.1）作為參考序列，利用序列比對軟件Mega 5.05將參考序列與74個個體測得的序列進行比對。結果顯示，在32頭成年豬和36頭后備母豬中各有1頭母豬為雜合子AB型，A等位基因頻率分別為0.0152和0.0139，其余均為中國豬種純合子BB類型。6頭仔豬為雜合子AB型種母豬的全同胞后代，其中有2頭為雜合子AB型，其余均為中國豬種純合子BB類型（表1）。經卡方檢驗，種豬、后備母豬以及仔豬在這兩個位點上處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05）。

圖3 -660 bp處單堿基缺失＞G突變

表1 廣東小耳花豬CYB5A基因型檢測結果

2.3 雜交結果分析

雜合子AB型的種母豬表型為正常廣東小耳花豬毛色（圖4A，封三），與BB型的廣東小耳花豬種公豬交配后，生出20頭仔豬，其中6頭仔豬毛色異常，呈現無規律的大小不一的黑色斑點（圖4B，封三），而非一整塊黑色，即非典型廣東小耳花豬毛色表型。對6頭毛色異常仔豬檢測，結果發現AB型有2頭，其余均為BB型。正常情況下，純種廣東小耳花豬母豬與杜洛克公豬雜交，后代均為全黑色個體或者部分白腳的毛色表型（圖4D，封三）。然而，該雜合子AB型種母豬與杜洛克公豬進行雜交后，后代中出現了類似杜洛克的紅色毛發個體（圖4C，封三），兩個組合后代表型均表明該種母豬確實混有外來豬的血緣。

3 討論

廣東小耳花豬是優良的地方豬種，肉質鮮美，但生長速度緩慢，日增重僅為260 g，瘦肉率為30.97%。實際生產中，通常將廣東小耳花豬作為母本，與杜洛克、長白豬進行經濟雜交生產杜×長×小耳花豬，商品豬既保留了母本皮薄肉嫩的特點，而且提高了日增重和瘦肉率［9］。因此，在利用廣東小耳花豬作為母本進行開發利用時，部分個體可能會導入外來豬種血緣，使得其品種資源混雜。Bai等［7］檢測了11種國內地方豬的CYB5A基因的啟動子，其中屬于華南型的藍塘豬和五指山豬、屬于華中型的上高豬、屬于江海型的嘉興黑豬以及浙江和江西地區的野豬全部均為BB型。然而，屬于華北型的民豬、漢江豬、里岔黑豬，屬于江海型的金華豬，屬于高原型的藏豬，屬于西南型的黔北黑豬和內江豬以及東北野豬均檢測出一定基因頻率的A單倍型，其中里岔黑豬A單倍型頻率最高，這與其品種形成過程中摻入外來豬種有關。外來豬種主要是歐洲豬種，其馴化與中國地方豬種是相互獨立的過程［10］。Ai等［11］通過全基因組重測序發現中國地方豬為適應南北方溫度，導致北方豬種基因組中很多位點與歐洲豬種相同，而與南方豬種之間存在差異。因此，廣東小耳花豬作為華南型豬種，其CYB5A基因的啟動子基因型應該為BB型。本試驗利用CYB5A基因進行檢測廣東小耳花豬種豬群體及其部分后代，僅發現2頭母豬為雜合子AB型以及2頭仔豬是雜合子AB型。經卡方檢驗，這兩個位點在種豬和后備母豬群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態（P＞0.05），表明外來豬種血緣沒有受到人工選擇。通過分子檢測，可以直接剔除該雜合個體進行品種提純。

豬的毛色有多種類型，包括野豬色、全黑色、全白色、全紅色、兩頭烏、烏云蓋雪、六白和黑白花豬等。研究表明，影響豬毛色的基因主要有黑素皮質素受體1（melanocortin receptor 1 gene，MC1R）［12］、酪氨酸酶相關蛋白1（Tyrosinase-related protein 1，TYRP1）［13］、v-kit貓科肉瘤病毒轉化基因（v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene homolog，KIT）［14］、刺鼠信號蛋白（agouti signaling protein，ASIP）［15］和內皮素受體B基因（endothelin receptor B gene，DNRB）［16］等。本次檢測的雜合子AB型廣東小耳花豬母豬毛色表型正常，分別與廣東小耳花豬公豬和杜洛克公豬交配后，兩次生產的仔豬均出現毛色異常的個體，同窩內出現毛色分離現象，驗證該母豬的血統不純。CYB5A基因位于1號染色體上，而很多毛色相關基因位于其他染色體上，滲入的外來豬基因在廣東小耳花豬群體中會發生染色體自由重組與分離。因此，單一對CYB5A基因啟動子中的突變位點進行檢測，僅能鑒定出中外豬品種的遺傳背景，而無法判斷雜合AB型個體中混有外來豬種的毛色基因。探究本試驗中仔豬出現了毛色分離現象，還需要進一步對多個毛色基因位點分析，才能判斷雜種母豬中混有的外來豬種毛色基因。

本研究結果表明廣東小耳花豬群體的血統基本純正，只有極少數個體混有外來豬種血緣，通過表型選擇與分子輔助育種相結合的方法可以準確、快速地進行品種提純，為廣東小耳花豬群體以及其他地方豬種保護提供科學的理論依據，防止地方品種中潛在優良基因資源的流失。

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（責任編輯 崔建勛）

Detection of genetic background of Guangdong Small-ear Spotted pig population by CYB5A gene

WANG Chen1，ZENG Jian-hua2，QIN-Ke1，HE Zu-yong1，CHEN Yao-sheng1，LIU Xiao-hong1
（1. School of Life Sciences，Sun Yat-sen University/State Key Laboratory of Biocontrol and Resources Utlization，Guangzhou 510006，China；2. Guangdong YIHAO Food Co.，Ltd.，Guangzhou 510620，China）

Guangdong Small-ear Spotted pig is the largest local pig breed raised in Guangdong province. This pig breed can be mixed with genes from exotic pigs during the rearing process by famers，and it is usually evaluated and bred through phenotype in actual production. Mutations in CYB5A gene promoter region could be applied in identifing different genetic backgrounds of Chinese and exotic pig breeds，so we detected Guangdong Small-ear Spotted pig population by molecular method to identify whether this breed was mixed with exotic pig breeds. CYB5A gene was amplified by PCR method and sequenced only by one direction，then the DNA sequences were analyzed to identify the mutations. The results showed that both 32 breeding pigs and 36 gilts had one heterozygotes of ABgenotype respectively and A allele frequency was 0.0152 and 0.0139，the remaining pigs were Chinese pig breed type of BB genotype. The 32 breeding pigs and 36 gilts were under Hardy-Weinberg equilibrium（P＞0.05） by Chi-Square tests，it indicated that the mutations from exotic pig breeds were not under human selection in Guangdong Small-ear Spotted pig population. The heterozygous sow had normal phenotype，it was mated with a pure Guangdong Small-ear Spotted boar and produced six abnormal colour pattern piglets，and two of them were heterozygotes of AB genotype by the detection. The heterozygous sows were also mated with a pure duroc boar and produced red coat piglets，which also validated that the sow was heterozygous and the molecular method was accurate. The results demonstrated that most of the Guangdong Small-ear Spotted pigs were purebreed，only a few individuals had been introgressed from exotic pig breeds. Combined phenotype selection with molecular-assisted selection methods，the local pig breed could be purified quickly and accurately.

Guangdong Small-ear Spotted pig；CYB5A gene；exotic pig breed；detection

S813；Q346+.5

A

1004-874X（2016）11-0122-05

2016-08-17

國家科技基礎性工作專項（2014FY120800）；廣東省科技計劃項目（2014B020202001）；廣東省揚帆計劃（2014YT02H042）

王晨（1988-），男，在讀博士生，E-mail: chenwangias@gmail.com

劉小紅（1970-），男，博士，研究員，E-mail：liuxh8@mail.sysu.edu.cn

王晨，曾檢華，秦珂，等. 基于CYB5A基因的廣東小耳花豬群體遺傳背景檢測［J］.廣東農業科學，2016，43（11）：122-126.