苜蓿高頻再生組織培養體系的優化

秦 楚，李 昱，張喜斌，麻冬梅，許 興

（1.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農業綜合開發辦公室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

苜蓿高頻再生組織培養體系的優化

秦 楚1，李 昱2，張喜斌1，麻冬梅3，許 興3

（1.寧夏大學生命科學學院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農業綜合開發辦公室，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學農學院，寧夏 銀川 750021）

以3個品種紫花苜蓿7日齡無菌苗的下胚軸為外植體，以MS培養基為基礎培養基，研究不同濃度激素配比對紫花苜蓿離體再生體系中愈傷組織的形成、不定芽誘導以及生根的影響。結果表明：金皇后、甘農1號、阿爾岡金愈傷組織誘導的最佳培養基分別為MS+2，4-D 2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L、MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L、MS+2，4-D 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L；不定芽誘導的最佳培養基分別為MS+6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 g/L、MS+NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L、MS+KT 1.2 mg/L；最佳生根培養基為1/2MS+IBA 1.0 mg/L。

苜蓿；激素；愈傷組織；再生體系

苜蓿（Medicaho sativa L.）是世界上分布最廣的一種豆科牧草［1］，享有“牧草之王”的美譽［2］，其本身具有一定的耐鹽能力，可在低濃度的鹽堿地中良好生長［3］。苜蓿不僅抗逆性強、適應范圍廣，還能為土壤提供大量有機質，改良土壤酸堿度。近年來，隨著我國土壤鹽堿化程度的加劇，迫切需要培育出抗逆性苜蓿品種［4］。由于傳統育種手段見效緩慢，而通過轉基因技術可更加快速有效地獲得目標品種。為了提高轉基因效率，建立最佳的植物再生體系尤為重要，早在1972年，Saunder等就從未成熟的苜?；ㄋ帯⒆臃?、子葉愈傷組織分化再生苜蓿植株獲得成功，標志著苜蓿組織培養研究的開始，自此大量苜蓿組織培養方面的研究得以開展［5-9］。然而，紫花苜蓿作為遺傳轉化的受體，存在轉化效率低、分化率低、生根困難和再生周期長等缺點，因此，本試驗通過研究不同激素的配比繼而有效提高苜蓿的再生組織培養體系，以期為苜蓿的遺傳轉化研究工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年在寧夏大學科技樓實驗室進行，供試苜蓿品種為中國草業公司提供的金皇后、甘農1號、阿爾岡金。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子消毒 挑選健康飽滿的苜蓿種子，置于100 mL錐形瓶中，用流水沖洗4～5次，去除漂浮于水面上的種子和雜質，移至超凈工作臺中。

1.2.2 無菌苗培養 先用75%酒精振蕩滅菌30 s，用滅菌的蒸餾水沖洗3次；再用0.1%HgCl2振蕩滅菌8 min后，蒸餾水沖洗4～5次；最后將處理后的苜蓿種子接種于MS培養基（附加瓊脂8 g/L、蔗糖20 g/L，121℃下高壓滅菌20 min，下同）上。培養條件為：溫度25℃，光照強度3 000～4 000 lx，光照12 h/d，連續光照7 d。

1.2.3 愈傷組織誘導 切取種子萌發培養基上生長7 d的無菌苗下胚軸（3～5 mm）為外植體，接種至分別添加不同濃度激素配比2，4-D、6-BA、NAA的MS培養基中（表1～表2），每個處理3次重復，每個重復接種25個外植體，置于25℃黑暗培養。形成愈傷組織后20 d統計愈傷組織誘導率，誘導率（%）=誘導出愈傷組織的外植體數/接種外植體總數×100。

1.2.4 愈傷組織分化 愈傷組織形成后，每隔15 d繼代培養1次，愈傷組織繼代3次后，挑選組織結構致密的淡黃色愈傷組織，接種至添加不同濃度激素配比的MS培養基（表3～表5）中，每個處理3次重復，每個重復接種20個愈傷組織，每隔15 d繼代培養1次。培養條件為：溫度25℃，光照強度3 000～4 000 lx，光照12 h/d。形成分化的小苗，60 d后統計分化率，分化率（%）=分化出芽的愈傷組織個數/接種愈傷組織總數×100。

1.2.5 生根培養 將出現1 cm左右不定芽的愈傷組織接種至添加不同濃度IBA（0、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/L）的1/2MS培養基（大量元素是MS培養基的50%，微量、維生素、鐵鹽含量保持不變，pH為5.8～6.2）中。培養條件為25℃、光照強度3 000～4 000 lx、光照12 h/d。培養約4周，發育成正常的植株。

1.2.6 煉苗移栽 去掉培養瓶的蓋子，向培養瓶中加入少量蒸餾水，在室內煉苗72 h，取出培養基中的幼苗，用蒸餾水洗凈根部培養基，移栽于混有滅菌的營養土∶蛭石（1∶1）的小花盆中，最初1周蓋上保鮮膜，每天通風3～5次，當幼苗長出莖葉時移入大棚。

2 結果與分析

2.1 不同激素配比對苜蓿愈傷組織誘導的影響

在誘導苜蓿愈傷組織過程中，培養基中加入不同濃度激素時，愈傷組織誘導率不同（表1～表2）。當2，4-D濃度逐漸升高時，金皇后和阿爾岡金愈傷組織誘導率呈上升趨勢，2，4-D濃度為2.5 mg/L時誘導率最高，說明此濃度是誘導金皇后和阿爾岡金愈傷組織的最適濃度。甘農1號在2，4-D濃度從2.0 mg/L提高至2.5 mg/L時，愈傷組織誘導率降低，說明高濃度抑制了甘農1號愈傷的形成，2.0 mg/L 2，4-D是其最佳的愈傷形成濃度。在相同2，4-D濃度下，隨著6-BA濃度的提高，金皇后愈傷組織誘導率大致呈現出先增加后降低的趨勢，說明過高濃度的6-BA會對金皇后愈傷的形成起到抑制作用。由表1可知，金皇后愈傷組織最佳誘導培養基為MS+2，4-D2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L。隨著NAA和KT濃度的提高，甘農1號和阿爾岡金愈傷形成率大致呈上升趨勢，表2顯示，當NAA濃度為1.0 mg/L時，甘農1號愈傷誘導率達最大值，其最佳培養基為MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；當2，4-D濃度為2.5 mg/L時愈傷形成率均達90%以上，說明低濃度2，4-D不利于阿爾岡金愈傷的形成，其最佳愈傷形成的培養基為MS+2，4-D 2.5 mg/L+KT 1.0 mg/L。三者比較可知，甘農1號在2，4-D與NAA誘導下愈傷形成率較高，均達到80%以上。

表1 不同激素配比對金皇后苜蓿愈傷組織誘導的影響

表2 不同激素配比對甘農1號、阿爾岡金苜蓿愈傷組織誘導的影響

表3 不同激素配比對金皇后苜蓿愈傷組織分化的影響

2.2 不同激素配比對苜蓿愈傷組織分化的影響

分化過程中，愈傷組織會膨大、變綠、出現綠點和長芽，MS培養基中添加不同濃度激素時，愈傷分化率差別較大，通常情況下，愈傷分化率都較低，當用同種激素來篩選時，不同濃度對愈傷組織分化誘導效果的差別也很大。表3顯示，當培養基中加入6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 mg/L時，金皇后的誘導率最大達11.67%，而在培養基中不加入任何激素誘導率也較高。由表4可知，甘農1號愈傷分化的誘導率相對高于金皇后，培養基中加入2.0 mg/L 6-BA時誘導率也較高，當培養基中加入NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L時誘導率最高可達13.33%，說明適量配比的生長素和細胞分裂素有助于甘農1號的分化。從表5可以看出，3種苜蓿相比，阿爾岡金愈傷分化誘導率最高、達20%以上，當培養基中加入2.0 mg/L 6-BA或NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L時，阿爾岡金分化率均達10%以上，當加入相同濃度的激素時，若加入0.5 mg/L CH均可提高誘導率。說明適量CH有助于愈傷組織的分化，阿爾岡金的最佳分化誘導培養基為MS+KT 1.2 mg/L+CH 0.5 mg/L。

表4 不同激素配比對甘農1號苜蓿愈傷組織分化的影響

表5 不同激素配比對阿爾岡金苜蓿愈傷組織分化的影響

2.3 不同濃度IBA對苜蓿生根移栽的影響

IBA對不定芽生根有一定的促進作用，在培養基中加入適量IBA有助于苜蓿的生根。由表6可知，在未添加IBA的培養基中，3個品種苜蓿的生根率均較低，隨著IBA濃度的增加，3個品種苜蓿的生根率均呈現上升趨勢，當IBA濃度為1.0 mg/L時生根率均達到最大。苜蓿的再生體系見圖1（封三）。

表6 不同濃度IBA對苜蓿生根率（%）的影響

3 結論與討論

植物的不同基因型和不同外植體均會對愈傷組織的形成產生一定影響［10］。David等［11］、楊廣東等［12］研究認為，下胚軸是誘導苜蓿愈傷組織的最佳外植體，因此，本試驗采用2，4-D與6-BA、NAA、KT配比對外植體進行愈傷組織的誘導，2，4-D在單獨使用或與其他激素配合使用時均能誘導出愈傷組織，李聰等［13］認為誘導苜蓿愈傷組織時，2，4-D是不可缺少的且最適濃度為2 mg/L。本試驗也證實當2，4-D濃度達到2 mg/L時，甘農1號的愈傷形成效果較好且比較致密，但在此濃度下金皇后和阿爾岡金的水浸化較嚴重，不便于下一步進行基因轉化試驗，適當提高2，4-D濃度可以使愈傷變得更致密，更有利于下一步試驗。另外，舒文華等［14］認為高濃度的2，4-D容易使愈傷組織褐化，本試驗也表明當2，4-D濃度超過甘農1號愈傷生長的最適濃度達到2.5 mg/L時，甘農1號的愈傷組織誘導率降低且易發生褐化現象。苜蓿再生體系的建立過程中，提高愈傷組織的分化效率是最主要問題。植物的外源激素對愈傷組織不定芽的分化起著重要作用［15-16］，不同激素對不同基因型苜蓿產生的影響也略有不同，3個品種苜蓿相比，當培養基中添加2.0 mg/L 6-BA時，阿爾岡金的分化率最高。多數植物組織培養過程中，2，4-D阻礙愈傷組織的分化［17］，本試驗也顯示，當培養基中加入2，4-D后，金皇后的分化誘導率降低；聶王星等［18］研究在培養基中添加適量的6-BA和TDZ對大豆的子葉節叢生芽的誘導有一定促進作用，而在本次試驗中，二者的配比并不能提高苜蓿愈傷的分化能力，可能是不同品種植物對激素的響應不同。呂東霞等［19］指出生長素和細胞分裂素結合使用比單一使用更有利于植物愈傷組織的分化，本試驗中，當培養基中添加NAA和KT時，甘農1號的分化率最高。李忠光等［20］報道了水解酪蛋白對煙草愈傷組織有促進作用，本試驗培養基中添加同種激素，當加入0.5 mg/L的水解酪蛋白時，阿爾岡金的分化率均提高。本研究結果表明，當1/2MS培養基中加入1.0 mg/LIBA時，3個品種苜蓿的生根率均最高，這與葛軍［21］的研究結果一致。

苜蓿再生體系存在再生周期長、植株再生率低等問題。一般從外植體誘導愈傷到得到再生植株需要3～5個月，在此過程中，愈傷分化出的綠苗數量較少，還會有出現白化苗現象，雖然本研究通過篩選激素濃度縮短了再生體系建立的時間，但仍存在重復性差、分化率低等問題，希望能夠進一步改良再生體系，建立更加高效的遺傳轉化體系，為轉基因工作奠定基礎。

［1］從學滋，秦孟根，王書安. 苜?？傇磉暗奶崛∨c分析［J］. 中藥通報，1998，13（9）：19-20.

［2］黃文惠，劉自學. 概論苜蓿的分布和發展［A］.耿華珠. 中國苜蓿［M］. 北京：中國農業出版社，1995.

［3］閻旭東，朱志明，李桂榮，等. 六個苜蓿品種特性分析［J］. 草地學報，2011，9（4）：302-306.

［4］黃遠新. 南方紫花苜蓿不同外植體離體培養的研究［J］. 中國草地，2003，25（3）：42-47.

［5］Saunder J M，Bingham B T. Production of alfalfa plants ：from callus tissue ［J］. Crop Sci，1972（12）：804-808.

［6］王家傳，張利莉. GsPPCK1和GsPPCK3基因轉化苜蓿及其耐堿性分析［J］. 塔里木大學學報，2014，26（2）：20-31

［7］徐博，任偉. 農桿菌介導的朝鮮堿茅PuP5CS基因轉化紫花苜蓿的研究［J］. 草業科學，2015，32（6）：895-901.

［8］薛曉鋒，周巖，陳亞東，等. 超聲波輔助農桿菌介導SeNHX1基因轉化紫花苜蓿的研究［J］. 中國農學通報，2014（18）：264-270.

［9］楊權，王月月，劉炎光，等. 豆子葉節遺傳轉化體系優化及抗逆基因AtNHX5的轉化研究［J］.大豆科學，2015（2）：205-211.

［10］楊青川. 苜蓿生產與管理指南［M］. 北京：中國林業出版社，2003.

［11］David A，Stuart，Carol M. McCall Induction of somatic embryogenesis using side chain and ring modified forms of phenoxy acid growth regulators［J］. Plant Physiol，1992，99：111-118.

［12］楊廣東，朱禎，李燕娥，等. 大白菜高效遺傳轉化體系的建立［J］. 農業生物技術學報，2002，10（2）：127-132.

［13］李聰，熊德邵，耿華珠. 苜蓿愈傷組織再生植株研究［J］. 中國草地，1989（3）：51-55.

［14］舒文華，耿華珠，閻倫興，等. 紫花苜蓿胚軸愈傷組織培養與植株再生［J］. 草業科學，1993，10（3）：65-67.

［15］王曉春，師尚禮，梁慧敏，等. 2，4-D和6-BA組合配比對金達苜蓿愈傷組織誘導與分化的影響［J］. 草業學報，2010，18（2）：119-222.

［16］張元新. 2，4-D濃度對苜蓿愈傷組織分化和再生的研究［J］. 吉林化工學院學報，2007，24（4）：14-16.

［17］崔凱榮，戴若蘭. 植物體細胞胚發生的分子生物學［M］. 北京：科學出版社，2000.

［18］聶王星，於丙軍. TDZ和6-BA對大豆子葉節再生體系中叢生芽誘導的效應［J］. 南京農業大學學報，2012，35（4）：130-134.

［19］呂冬霞，曲長福. 植物生長調節劑對愈傷組織培養的影響［J］. 北方園藝，2004（5）：68-72.

［20］李忠光，龔明. 水解酪蛋白對煙草愈傷組織和懸浮培養細胞生長的促進作用［J］. 云南師范大學學報，2006（4）：60-61.

［21］葛軍. 紫花苜蓿組織培養再生體系的研究［D］.北京：北京林業大學，2004.

（責任編輯 張輝玲）

Optimization of high-frequncy regeneration system of Alfalfa

QIN Chu1，LI Yu2，ZHANG Xi-bin1，MA Dong-mei3，XU Xing3
（1.School of Life Science，Ningxia University，Yinchuan 750021，China；2. Agricultural Comprehensive Development Office of Ningxia，Yinchuan 750021，China；3. School of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，China）

Hypocotyls of 3 varieties of Alfalfa in 7 days old seedlings were used as explants，Ms medium was used as basic medium，the effects of different concentrations of auxins on Alfalfa callus regeneration system，adventitious bud induction and rooting were studied. The results indicated that， for Golden Empress，Gan-nong No.3 and Algonquin，the best mediums for callus induction were MS+2，4-D 2.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L，MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L，MS+2，4-D 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L；the best differentiation mediums were MS+6-BA 2.0 mg/L+CH 0.5 g/L，MS+NAA 0.3 mg/L+KT 0.5 mg/L，MS+KT 1.2 mg/L；the best rooting medium for plant development were 1/2MS+IBA 1.0 mg/L.

Medicaho sativa L.；hormones；callus；regeneration system

S541+.1

A

1004-874X（2016）11-0022-05

2016-07-17

項目來源：寧夏自然科學基金（NZ15002）

秦楚（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：932505357@qq.com

許興（1959-），男，博士，教授，E-mail：495323582@qq.com

秦楚，李昱 ，張喜斌，等. 苜蓿高頻再生組織培養體系的優化［J］.廣東農業科學，2016，43（11）：22-26.