不同熱處理對甘蔗蔗莖脫毒效果的影響

武媛麗，王俊剛，蔡文偉，張樹珍，楊本鵬

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心/中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 海口 571101）

不同熱處理對甘蔗蔗莖脫毒效果的影響

武媛麗，王俊剛，蔡文偉，張樹珍，楊本鵬

（中國熱帶農業科學院甘蔗研究中心/中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所/農業部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室，海南 海口 571101）

為確定甘蔗脫毒的最佳方式，以期為甘蔗脫毒健康種苗的生產提供一條切實可行的途徑，將甘蔗蔗莖分別置于不同溫度的恒溫水浴中進行不同時間的恒溫熱處理。結果表明：不同熱處理對蔗莖處理7 d后，低于52℃的各處理萌芽率均在90%以上，52℃處理30 min以內萌芽率均為60%以上，其余處理蔗莖萌芽率低于30%；當熱處理溫度高于55℃、58℃和61℃時可以分別獲得脫去宿根矮化病（RSD）、花葉病毒（ScMV）和黃葉病毒（ScYLV）的腋芽，但是蔗莖萌芽率低于20%；而在52℃恒溫熱處理30 min后經過38℃恒溫氣候箱中培養1周后，蔗芽生長點均未檢測出以上3種病原微生物。以此最佳條件，研究了心葉誘導愈傷組織培養、腋芽培養、溫水處理種植和恒溫熱處理結合腋芽分生組織培養4種脫毒方式的脫毒效果，發現心葉誘導愈傷組織培養和恒溫熱處理結合腋芽分生組織培養脫毒效果最佳，但是繼代培養過程中發現，經誘導愈傷組織培養產生的無性系后代中變異個體較多。因此，恒溫熱處理結合腋芽分生組織培養為甘蔗的最有效的脫毒途徑，可以培養出脫毒健康種苗。

熱處理；脫毒健康種苗；甘蔗種莖；分生組織培養

甘蔗（Saccharum officinarum L.）是熱帶、亞熱帶地區的重要經濟作物和糖料作物，同時也是生產乙醇、葡萄糖等原料的能源作物［1］。中國是世界主要產糖國之一，對保障國內食糖供給、促進國民經濟發展以及提高人們生活質量都具有重要作用［2］。甘蔗是無性繁殖作物，經過多年宿根栽培后會受到多種病原物的反復侵染，使種性退化，造成甘蔗產量和蔗糖分含量下降。花葉病、黃葉病和宿根矮化病是造成甘蔗品種退化的主要原因，采用普通物理化學方法難以根除，成為甘蔗單產及蔗糖分含量提高的主要制約因素［3］。已有研究表明，頂端分生組織培養對甘蔗波條病、嵌紋病、宿根矮化病、花葉病和白葉病的脫毒效果明顯［4］；愈傷組織培養對霜霉病、嵌紋病、宿根矮化病和白葉病具有脫除效果［4］。目前，已報道的采用愈傷組織莖尖培養、溫水處理、恒溫熱處理結合分生組織培養對感花葉病和宿根矮化病的植株進行脫毒，均有一定效果［5-6］，但仍然缺乏關于甘蔗種莖最佳脫毒方式的系統研究。本研究比較研究了不同熱處理溫度、熱處理時間及不同的新生代植株獲取方式對種苗脫毒效果的影響以期找出甘蔗綜合脫毒的有效方法，為甘蔗脫毒健康種苗的培育及其產業化繁育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料選用中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所臨高試驗基地繁育的新臺糖22號常規蔗種。試驗處理前檢測蔗種是否攜帶宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp. xyli）、花葉病毒（ScMV、SrMV、ScSMV）和黃葉病毒（ScYLV），并選擇帶病蔗種進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 甘蔗種莖恒溫熱處理 將蔗莖粗細大小一致的供試材料砍成單芽莖段，置于46℃、49℃、52℃、55℃、58℃、61℃的恒溫水浴中分別浸泡24、27、30、33、36 min（表1），然后將以上材料置于38℃人工氣候箱恒溫恒濕培養［6］，每個處理50個單芽莖段。培養3、7 d后分別觀察每個處理蔗芽的生長狀態，同時檢測蔗芽的病原攜帶情況。

表1 甘蔗種莖恒溫熱處理設計

1.2.2 甘蔗新生代植株獲取方式 （1）愈傷組織培養。將供試植株的梢部砍下消毒，在無菌條件下繼續剝去外葉，留下直徑為0.4～0.6 cm的心葉，切成0.5～1 mm厚的薄片，接種于MS+2，4-D 1.5 mg/L+蔗糖30 g/L（pH 5.8）的固體培養基中培養，誘導出愈傷組織，將具有分化能力的愈傷組織（淡黃色、松散）接種于MS+6-BA 2 mg/L+3%蔗糖（pH 5.8）的固體培養基中分化成苗，進行繼代培養。選取30個芽段進行試驗。

（2）腋芽培養。將直徑大小一致的供試植株砍成3～4 cm長的單芽莖段，置于52℃蒸餾水恒溫水浴浸泡30 min，期間不斷攪拌。取出對外表皮消毒后，接種于起始培養基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+PVP 200 mg/L+蔗糖30 g/L）中，于28℃自然散射光下培養10～15 d，待芽萌動長至2～3 cm時，剝取腋芽進行繼代培養。選取30個芽段進行試驗。

（3）溫水處理種植。將直徑大小一致的供試植株砍成7～8 cm長的單芽莖段，置于52℃蒸餾水恒溫水浴浸泡30 min，期間不斷攪拌。熱處理后，直接種植于室外花盆中（土壤采自大田）。選取30個芽段進行試驗。

（4）熱處理結合腋芽分生組織培養（簡稱“綜合脫毒培養”）。將5～6 cm長的單芽莖段置于52℃蒸餾水恒溫水浴中，經過30 min熱處理后置于38℃人工氣候箱中恒溫恒濕培養。1周后當芽長至7～8 cm時取出，剝取芽尖1 cm左右，外表皮殺菌消毒后，在超凈工作臺上剝取生長點0.1～0.2 cm，接種于起始培養基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+PVP 200 mg/L+蔗糖30 g/L，pH 5.8）中，于28℃自然散射光下培養40～50 d，期間每隔1～2周更換1次培養基［6］，培養成苗后進行繼代培養。選取30個芽段進行試驗。

1.2.3 甘蔗新生代植株病原檢測 使用E. Z. A. N Plant RNA Kit（Omega Biotech Limited，India）試劑盒，按照試劑盒方法提取以上各處理的新生代植株總核酸，提取的總核酸用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo scientific，USA）試劑盒，按照試劑盒說明書進行反轉錄，得到cDNA，作為PCR反應的模板。

應用宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）病原菌的特異性引物進行常規PCR擴增，應用甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，ScMV）、高粱花葉病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）、甘蔗線條花葉病毒（Sugarcane streak mosaic virus，ScSMV）和甘蔗黃葉病毒（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）的特異性引物對反轉錄產物進行PCR擴增（表2）。PCR結束后，取5 μL產物進行l%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 聚合酶鏈式反應中的引物及反應條件

2 結果與分析

2.1 不同熱處理方式對蔗莖腋芽生長的影響

經過不同恒溫熱處理后，將蔗莖沿腋芽進行縱切后，其腋芽剖面無明顯差異（圖1，封二）。處理后3 d，46℃、49℃各處理蔗莖萌芽率在83.3%～100%，52℃各處理蔗莖的發芽率與49℃各處理相比明顯下降；52℃熱處理27 min和30 min后蔗莖萌芽率達到63.3%，隨著熱處理時間的增加萌芽率急劇下降，在熱處理36 min后萌芽率僅13.3%（表3）；55℃及以上各處理的蔗莖萌芽率為0。

從圖1（封二）可以看出，處理后3 d，46℃、49℃的全部處理以及52℃熱處理27、30、33 min處理萌發的芽經縱剖后發現生長形態與對照無明顯差異，但隨著處理時間及溫度的增加（52℃處理36 min以及55℃、58℃、61℃各處理），與對照形成了明顯差異，表現為腋芽不萌發甚至死亡（圖1，封二）。

在處理后7 d，46℃各處理蔗芽生長良好，成活率達到100%，芽高在7～8 cm之間；49℃處理24、27、30 min均無死亡個體，而當處理時間達到33 min時開始有個別蔗芽死亡，該溫度下蔗莖總體萌芽率達98%、芽高7～8 cm；當處理溫度升至52℃時，隨著浸種時間的延長，蔗莖萌芽率逐漸降低（表3），當處理時間在27、 30 min時蔗莖萌芽率達66.7%，處理時間超過30 min時萌芽率為26.7%～30.0%，蔗芽生長受到抑制；當處理溫度上升至55℃時，萌芽率低于6.7%，所萌生的蔗芽生長停滯；隨著處理溫度升高至58℃、61℃時，蔗芽全部死亡。

表3 不同熱處理方式對蔗莖腋芽生長情況的影響

由圖1（封二）可知，處理后7 d，46℃、49℃各處理蔗莖以及52℃處理27、30 min所萌發的蔗芽繼續伸長，經縱剖后發現其生長形態與對照無明顯差異。52℃33 min處理所萌發的蔗芽再無明顯伸長，且與對照的生長形態有明顯差異，說明在此條件下蔗芽生長已受到抑制。隨著處理時間的延長以及處理溫度的提高（52℃36 min以及55℃、58℃、61℃各處理），蔗芽表現為發黑死亡（圖1，封二）。

2.2 不同熱處理方式對蔗莖腋芽脫毒效果的影響

當熱處理溫度分別高于55℃、58℃和61℃時，RSD、SrMV和ScYLV在蔗莖腋芽中未檢測出（圖2）。但是，以上結果表明55℃以上的蔗莖發芽率低于30%。而在熱處理后再經1周38℃恒溫培養（組合標號為13’～15’），剝離蔗芽的生長點進行檢測均未檢測出RSD、ScMV和ScYLV，說明在52℃恒溫熱處理30～36 min后經過38℃恒溫氣候箱中培養1周后，蔗芽生長點已經達到較好的脫毒效果，而蔗莖萌芽率在52℃恒溫熱處理33和36min后不足30%，因此，30min為最佳熱處理時間。

2.3 不同培養途徑獲得的新生代蔗苗攜帶病原菌檢測比較

從病原菌檢測情況來看，通過心葉愈傷組織誘導培養和綜合脫毒培養兩種途徑獲得的新生代植株均未檢測出宿根矮化病、高粱花葉病和甘蔗黃葉病病原菌，達到了脫毒目的；而經過腋芽培養和溫水處理種植兩種途徑獲得的新生代植株，仍攜帶有病原菌（圖3）。從繼代培養情況來看，經愈傷組織誘導培養途徑產生的新生代植株存在很大程度的變異（主要表現為白化、繼代培養后逐漸死亡），而綜合脫毒培養所產生的新生代植株中沒有發現變異株（圖4，封二）。

3 結論與討論

圖2 不同熱處理方式對蔗莖腋芽脫毒效果的影響

3.1 恒溫熱處理對甘蔗花葉病有顯著的鈍化作用

甘蔗花葉病是發生在甘蔗上最普遍、為害最嚴重的一類病毒［7］，其病原至少有甘蔗花葉病毒（ScMV）、高粱花葉病毒（SrMV）、甘蔗線條花葉病毒（ScSMV）［8］3種。本試驗對不同熱處理溫度和時間下蔗莖的脫毒效果進行了比較，同時研究了4種生產上常用的脫毒方法對花葉病病原的脫毒效果，結果發現，在所有供試材料中均檢測到SrMV，而未檢測出ScMV和ScSMV，因此供試材料感染花葉病的病原為SrMV，這與熊國如等［7］對海南蔗區甘蔗樣品的毒源檢測和分子鑒定所得到的結果一致。供試材料經4種不同途徑獲得了新生代植株，發現經愈傷組織誘導培養和綜合脫毒培養途徑方法所得到的新生代植株中均未檢出有SrMV，而通過腋芽培養和溫水處理種植兩種途徑獲得的新生代植株均未達到脫毒效果，這可能是因為：經過52℃、30 min的恒溫熱處理后，并未經過38℃恒溫培養使芽快速抽高，而使腋芽在常溫下緩慢伸長，導致莖稈中未能脫除的病原由維管束作為介質重新分布于生長的芽中，因此經恒溫熱處理后直接接種或種植的帶芽莖段出芽后檢測均為帶毒芽；而綜合脫毒培養途徑可能是由于存在芽中的病毒經恒溫熱處理后已經鈍化［9］，通過胞間連絲移動速度相對緩慢，病毒傳播的速度遠遠低于植物細胞的復制速度；莖尖分生組織的維管束尚未形成，無法通過此途徑傳播病毒［3］。因此，由綜合培養脫毒獲得的新生代植株可以脫除花葉病毒，SrMV能經多種蚜蟲以非持久性方式傳播，但田間再侵染不明顯，田間發病率主要取決于種苗帶毒率［10-11］。

圖3 不同培養途徑獲得的新生代蔗苗攜帶病原菌檢測結果

3.2 快速催芽能獲得不帶宿根矮化病、黃葉病的甘蔗植株

甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease，RSD）由寄居于維管束木質部的革蘭氏陽性細菌Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx）引起［12］，是造成甘蔗減產的主要病害之一，在全球廣泛發生［13］。本研究結果表明，該病菌在經恒溫熱處理后不能完全脫除，而綜合脫毒培養途徑能使其快速抽芽，取出莖尖生長點進行無菌培養所得新生代植株檢測不到RSD，因此可通過恒溫熱培養快速催芽來獲得不帶宿根矮化病的甘蔗新生代植株。

我國于2001年在廣西南寧首次發現甘蔗黃葉病（Sugarcane yellow leaf virus，ScYLV）［14］，此后廣東、云南、福建、貴州、海南以及廣西大部分地區都發現甘蔗黃葉病［7，15-21］，可見其傳播范圍廣、速度快。黃葉病已成為影響甘蔗產量的一個主要病毒病害［7］，甘蔗的整個生育期均可受到黃葉病毒的侵染，尤其是在甘蔗生產后期黃葉病毒大多表現出典型癥狀。從經過本試驗中4種途徑獲得的新生代植株的檢測結果可以看出，愈傷組織誘導培養和綜合脫毒培養兩種途徑均可以很好地脫除甘蔗黃葉病病毒，而腋芽培養和溫水處理種植兩種途徑所得到的新生代植株均攜帶病毒。

3.3 蔗莖綜合脫毒培養方式可以獲得脫毒健康種苗

甘蔗抗性品種缺乏與種性退化是制約甘蔗發展的主要瓶頸，由宿根矮化病和甘蔗病毒病等病害引起的危害是導致種性退化的主要因素之一，但目前尚無有效的防除技術，所以采用脫毒甘蔗種苗是最有效的防治措施。然而，在脫毒效果理想的兩種方法（即愈傷組織誘導培養和綜合脫毒培養）中，愈傷組織誘導培養由于其無性系后代產生變異程度較高，不適合用于生產，這與許莉萍等［22］研究結論一致，愈傷組織培養能達到較好脫毒效果的原因可能是愈傷組織中病毒的復制速度趕不上細胞增殖速度。

本試驗結果表明，熱處理程度低于52℃、30 min（1’～12’處理），雖然種芽生長良好、成活率較高，但脫毒效果不理想；熱處理程度高于52℃、30 min（14’～30’處理），雖然其莖尖分生組織區域的脫毒效果十分理想，但成活率非常低，芽生長嚴重受阻甚至大量死亡。在實際生產中，要綜合考慮種芽生長情況和脫毒效果，我們認為52℃處理30 min（13’處理）效果最佳，不僅蔗芽生長情況良好，且脫毒效果優，可以滿足實際生產需要。經過52℃30 min的熱處理后38℃恒溫培養1周使其抽芽，取莖尖分生組織培養可以有效脫除病原菌，這可能是因為：（1）病原菌的傳播是通過維管束組織在植物體內進行傳輸，而莖尖分生組織區域內無維管束組織，病原菌通過胞間連絲的傳播速度慢于細胞的分裂和生長速度，因此莖尖分生組織所含病原菌數量微少，不在檢出范圍［3］；（2）高溫熱處理可有效去除大部分甘蔗宿根矮化病病原并使部分甘蔗花葉病病毒失活，之后再用38～40℃恒溫進行連續處理，使蔗芽快速伸長的同時抑制病毒、病菌的生長和傳播，使莖尖分生組織離病原更遠些，有利于切取到不攜帶病原的莖尖分生組織，從而達到徹底脫毒的效果［23-24］。而經過腋芽培養和溫水處理種植兩種途徑，可能是由于部分病原菌仍然存活于莖尖分生組織以外的其他有維管束的組織中，但是此部分組織未經切除，因此仍會攜帶病原菌。

綜上所述，雖然愈傷組織誘導培養的脫毒方法效果顯著，但因其在繼代培養過程中變異率較高，存在操作不便和成本增加等問題，無法滿足生產需要，因此不適合應用于實際生產。經熱處理后不進行莖尖分生組織培養（腋芽培養途徑和溫水處理種植途徑），則無法將病原菌徹底清除，植株仍攜帶有病原菌。通過52℃恒溫熱處理30 min結合腋芽分生組織培養途徑是應用細胞生物學、分子生物學、作物栽培與耕作學等原理，通過蔗莖綜合脫毒、無突變快繁、病原快速檢測等環節獲得［6］。本試驗通過對甘蔗莖段進行52℃熱處理30 min、38℃恒溫培養結合腋芽分生組織培養，有效去除了甘蔗攜帶的宿根矮化病、花葉病和黃葉病等病原菌，實現了脫毒與快繁的統一，可見蔗莖綜合脫毒方式是獲取甘蔗脫毒健康種苗的有效途徑。

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（責任編輯 張輝玲）

Effects of different treatments on efficiency of virus-free seed-stems of sugarcane

WU Yuan-li，WANG Jun-gang，CAI Wen-wei，ZHANG Shu-zhen，YANG Ben-peng
（Sugarcane Research Center of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology of Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops，Ministry of Agriculture，Haikou 571101，China）

In order to find out the most efficient pattern to get virus-free sugarcane，and provide a viable way to produce healthy sugarcane seedlings. We put seed-stems of sugarcane into different thermostat water baths. The results revealed that the percentage of germination was higher than 90% when the temperature was lower than 52℃ after 7 days of different hot water baths，and was higher than 60% when the temperature was 52℃ and the time was 30 minutes，and was lower than 30% in other treatments. When the temperature was above 55℃，58℃and 61℃，we could get sprouts without ratoon stunting disease，sugarcane mosaic virus and sugarcane yellow leaf virus respectively，but percentage of germination was lower than 20%. However，if we put the seed-stems in 52℃thermostat water bath for 30 minutes then cultivated in 38℃ thermostat for one week，we cann’t detect pathogenic microorganisms in growing points of sugarcane. Then under the best condition，we compared the efficiencies of four virus-free ways: callus induced from heart leaves，axillary bud cultivated，putting into warm water before planting and hot water bath combined with meristems of axillary bud cultivated. The first and the forth method were better thanothers. However，after several times transfers of culture，there were more mutants when the callus induced from heart leaves. Thus，hot water bath combined with meristems of axillary bud cultivated was the best treatment，which could cultivate healthy sugarcane seedlings.

thermal treatment；virus-free seedlings；seed-stems of sugarcane；meristems culture

S432.1；S566.1

A

1004-874X（2016）11-0014-08

2016-08-23

國家現代農業產業技術體系建設專項資金（CARS-20-6-11）；海南省重大科技項目（ZDZX 2013023-3-01）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金（1630052015036）

武媛麗（1982-），女，碩士，助理研究員，E-mail：21csyh@163.com

楊本鵬（1964-），男，研究員，E-mail：y-bp@163.com

武媛麗，王俊剛，蔡文偉，等.不同熱處理對甘蔗蔗莖脫毒效果的影響［J］.廣東農業科學，2016，43（11）：14-21.