一例多種病毒混合感染的實驗室診斷及綜合防制措施

楊凡，李萍，樊毅，趙軍，陳盼，朱玲，2，徐志文，2

（1.四川農業大學動物生物技術中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

一例多種病毒混合感染的實驗室診斷及綜合防制措施

楊凡1，李萍1，樊毅1，趙軍1，陳盼1，朱玲1，2，徐志文1，2

（1.四川農業大學動物生物技術中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

2016年3月，彭州某豬場出現疑似豬藍耳病病毒（PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）混合感染嚴重疫情，豬群發病率和死亡率較高。為進一步確診和提供科學的防控依據，采集10頭繁殖障礙母豬（未曾注射PRRSV疫苗）血樣，用IDEXX試劑盒進行豬瘟病毒（CSFV）、PRRSV和PRV gE抗體檢測。同時采集2頭流產胎兒（對應2頭流產母豬）組織分別進行CSFV、PRRSV的RT-PCR檢測和PRV gE的PCR檢測，采集2頭腹瀉同時伴隨神經癥狀的仔豬組織進行TGEV、PEDV、豬輪狀病毒（RV）的RT-PCR檢測和PRV gE的PCR檢測。結果顯示，母豬CSFV抗體陽性率達90%，對應流產胎兒未檢出CSFV，表明無CSFV感染，免疫合格；PRRSV和PRV gE抗體陽性率達100%，對應流產胎兒均測出PRRSV和PRV，表明這兩種病毒感染情況嚴重；2頭仔豬PCR和RT-PCR結果提示均有PRV、PEDV和TGEV野毒感染，并根據以上檢測結果提出緊急防控措施。

PRRSV；PRV gE；TGEV；PEDV；混合感染

2016年3月，彭州某豬場大量母豬（未曾注射豬藍耳病疫苗）發生繁殖障礙，表現為流產，產死胎和木乃伊胎；2周齡以內仔豬突發嘔吐、拉灰白色或黃綠色稀糞，腥臭味嚴重，且部分仔豬出現臥地不起、四肢如“劃水狀”神經癥狀，死亡率達95%以上。仔豬剖檢發現肺淤血、水腫、肉變；脾腫大；小腸腸壁變薄、透明，腸內有灰綠色或黃白色黏稠液體；胃內含大量凝乳塊；腎臟散在針尖大小出血點；全身淋巴結不同程度腫大、出血，尤其是肺門淋巴結和腸系膜淋巴結；腦充血、出血。初步診斷為豬藍耳病病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV）、豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissiblegastroenteritis virus,TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）混合感染[1-4]，可能還有豬輪狀病毒（Rotavirus,RV）感染[5]，為進一步確診并為豬場擬定緊急防控措施，特采集樣品進行實驗室診斷。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2016年3—4月在四川農業大學動物生物技術中心實驗室進行。

1.2 試驗試劑

Trizol細胞裂解液、RT-PCR反轉錄試劑盒、2× Taq PCR Master Mix、Taq HS酶、2×GC buffer和dNTP Mixture均購自寶生物工程（大連）有限公司；美國愛德士（IDEXX）豬瘟病毒（CSFV）、PRRSV和PRV gE抗體檢測試劑盒，均購自四川佑策農業技術咨詢有限公司；飽和酚、氯仿（氯仿和異戊醇體積比24∶1）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）。

1.3 試驗器材

美國Thermo Micro21R微量離心機購自賽默飛成都分公司；美國BIO-RAD酶標儀、PCR儀均購自成都百樂科技有限公司；Eppendorf（EP）管、10 mL注射器。

1.4 樣品采集及處理

選取10頭繁殖障礙母豬（編號1～10），耳緣靜脈采血2～3 mL，室溫靜置1 h后自然析出血清[6]，轉移至無菌EP管中，帶回實驗室檢測CSFV、PRRSV和PRV gE抗體。

無菌采集2頭流產胎兒（編號A和B，對應1號和2號母豬）肺、脾臟和小腦，以檢測CSFV、PRRSV、PRV gE；無菌采集2頭腹瀉同時伴隨神經癥狀的仔豬（編號C和D）肺、脾臟、小腸及腸系膜淋巴結和三叉神經節，以檢測PEDV、TGEV、RV。將組織剪碎、研缽研磨，加PBS制成1∶5組織懸液，置-20℃和37℃反復凍融3次，4℃3 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.5 抗體檢測

采用酶聯免疫吸附試驗（ELISA）方法，運用IDEXX公司抗體檢測試劑盒，對分離的10頭繁殖障礙母豬血清進行CSFV、PRRSV和PRV gE抗體檢測。試驗設置陰、陽性對照各2孔，并嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 引物設計

CSFV、PRRSV和PRV gE引物均由動物生物技術中心實驗室設計，參照文獻[7]設計PEDV、TGEV和RV引物（表1）。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 樣品檢測所用引物

1.7 病料總RNA抽提及RT-PCR擴增

取適量A、B胎兒和C、D仔豬病料的上清液，用Trizol法抽提病料總RNA，具體操作步驟參照文獻[8]。按照反轉錄試劑盒說明書制備cDNA，RT-PCR反應體系10.0 μL：ddH2O 3.0 μL，2×Taq PCR Master Mix 5.0 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模板1.0 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，53～57℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環30次；72℃總延伸7 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.8 病料總DNA抽提及PCR擴增

取適量A、B胎兒和C、D仔豬病料制備的上清液，用飽和酚、氯仿法抽提病料總DNA，具體操作步驟參照文獻[8]。PRV gE的PCR反應體系10.0 μL：2× GC buffer 4.5 μL，ddH2O 1.0 μL，dNTP 2.0 μL，DNA模板1.0 μL，PRV上游引物0.5 μL，PRV下游引物0.5 μL，Taq HS酶0.5 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次；72℃總延伸7 min。產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

2 結果

2.1 ELISA檢測結果

10頭繁殖障礙母豬血清檢測結果顯示，CSFV陽性率達90%，PRRSV和PRV gE陽性率達100%，詳見表2。

表2 母豬抗體檢測結果

2.2 流產胎兒鑒定結果

2頭流產胎兒經RT-PCR和PCR鑒定，提示均為CSFV陰性，高致病性藍耳病病毒和PRV gE陽性（圖1—圖3）。

圖1 CSFV RT-PCR鑒定結果

圖2 PRRSV RT-PCR鑒定結果

圖3 PRV gE PCR鑒定結果

2.3 仔豬鑒定結果

檢測結果提示，2頭仔豬均為PEDV和TGEV陽性，RV陰性，PRV gE陽性（圖4—圖7）。

圖4 PEDV RT-PCR鑒定結果

圖5 TGEV RT-PCR鑒定結果

圖6 RV RT-PCR鑒定結果

圖7 PRV gE PCR鑒定結果

3 討論

CSFV、PRRSV和PRV一直以來都是危害我國養豬業的重大傳染病，幾種病毒均可引起種公豬、母豬繁殖障礙。病毒可垂直傳播給子代，導致母豬流產，產死胎、木乃伊胎和弱胎等，仔豬發病率和死亡率較高，感染豬耐過后一般發育狀態不佳[1-2]。目前，CSFV和PRV一般通過注射疫苗來進行防控，但關于是否給豬群注射弱毒疫苗以預防PRRSV野毒感染，一直都是學術界討論的熱點。市售的CSFV疫苗一般包括脾淋苗和細胞苗[9]，前者是經CSFV感染兔之后，經非適宜宿主弱化后，采集兔脾臟和淋巴結等制作而成，產生抗體所需劑量較大，成本高；后者是經細胞傳代獲得，抗原含量高，成本低廉，目前臨床上一般將兩種疫苗混合使用。如今所用的PRV疫苗，均缺失過gE毒力基因[10]，因此通過ELISA技術即可診斷豬群是否感染野毒。本文采集的10頭未曾注射過PRRSV疫苗的繁殖障礙母豬血樣，采用IDEXX公司抗體檢測試劑盒，進行CSFV、PRRSV和PRV gE檢測，同時對1、2號母豬的流產胎兒采樣檢測CSFV、PRRSV和PRV gE，抗體檢測結果顯示，CSFV陽性率達90%，PRRSV和PRV gE陽性率達100%，PCR和RT-PCR結果顯示CSFV陰性，PRRSV和PRV gE陽性，綜合結果表明豬群可能未感染CSFV野毒，其抗體合格率也達到我國農業部規定以上（群體合格率≥70%），但母豬已感染PRRSV和PRV gE，并經胎盤屏障傳播給胎兒，由此才能在胎兒組織中檢測出這兩種病毒。

2頭腹瀉并伴有神經癥狀仔豬的PCR和RTPCR檢測結果提示，2頭豬均有PEDV、TGEV和PRV野毒感染，與根據臨床癥狀和病理解剖推論的初步診斷結果大致相符（RV陰性）。PEDV和TGEV是引起仔豬腹瀉的主要病毒，各年齡豬均可發病，患病豬突發嘔吐、嚴重腹瀉，最終脫水死亡。PEDV主要感染10 d以內仔豬，死亡率高達100%，在群體中傳播速度很快，尤其是在密閉、豬只集中的豬場，病理剖檢主要是腸壁變薄、透明，黏膜出血，腸系膜淋巴結高度充血、腫大；對于TGEV，哺乳仔豬感染后死亡率相對較低，且傳播速度也相對較慢，病理解剖可見胃底部出血嚴重，且胃內含有大量乳白色凝乳塊[3-4]。臨床調查結果表明，二者混合感染情況嚴重，且多發于寒冷季節，本次豬場發病即在3月份。RV感染癥狀與前兩者相似，但發病情況相對較輕，致病性較強的主要為A群[5]。PRV野毒感染后，母豬和公豬均可出現繁殖障礙，成年豬一般呈隱性感染，可長期向外排毒，但仔豬感染率和死亡率較高，且出現諸如本試驗中2頭患病仔豬所表現出的四肢如劃水樣神經癥狀（PRV具強噬神經性）[2]。這幾種病毒對仔豬危害巨大，一旦發病將造成豬場的嚴重損失，因此豬場平時采取的防控措施起著舉足輕重的作用。

綜合所有檢測結果，發現該豬場為PRRSV、PRV、PEDV和TGEV多種病毒混合感染，建議立即展開緊急防御措施，避免造成更大損失。方案如下：第一，立即隔離飼養未發病豬群，對病死豬依照相關規定進行撲殺或焚燒掩埋，同時做好整個養殖場的消毒、防疫工作，以切斷傳染源和傳播途徑，且可以防止細菌繼發感染。第二，采集未發病豬只的血液樣品，運用ELISA技術監測豬群的PRV gE和gB抗體，立即淘汰gE抗體陽性豬，對可疑豬只隔離飼養，并采集血樣進行重測，同時對PRV gB抗體陰性豬立即補免PRV疫苗，以刺激產生抗PRV抗體。第三，合理調節飼料配方和日喂量，可適當加入諸如黃芪多糖等可提升機體免疫力的藥物，以增強機體抵抗力。

[1]劉國信.豬偽狂犬病、豬瘟、藍耳病混合感染的診治[J].畜牧市場，2010（12）：55-56.

[2]許立華，王玲，蘆銀華，等.三種豬繁殖障礙性病毒混合感染的分子生物學調查[J].中國獸醫科技，2004，34（7）：40-43.

[3]顏其貴.豬腹瀉病毒病概述[J].飼料與畜牧·規模養豬，2013（4）：1-2.

[4]任玉鵬，陳弟詩，蘇生禹，等.三種豬腹瀉病毒性病原多重RT-PCR檢測方法的建立及應用[J].中國獸醫科學，2013（10）：1047-1051.

[5]龐昕，紫家前，趙宏坤，等.豬輪狀病毒感染研究進展[J].動物醫學進展，2000（4）：43-45.

[6]張麗娟，張桂芳，于憲倉，等.動物的血樣采集和血清分離技術[J].中國動物保健，2011（7）：33-34.

[7]Song D S,Kang B K,Oh J S,et al.Multiplex reverse transcription-PCR for rapid differential detection of porcine epidemic diarrhea virus,transmissible gastroenteritis virus,and porcine group A rotavirus[J].J Vet Diagn Invest,2006,18(3): 278-281.

[8]趙軍，朱玲，徐志文.一例嚴重豬乙型腦炎與偽狂犬病混合感染的診斷[J].養豬，2016（1）：108-110.

[9]文崇利，蘭家暖，楊厚德，等.豬瘟細胞苗和脾淋苗免疫效果的對比試驗[J].黑龍江畜牧獸醫，2015（4）：107-108.

[10]楊毅，李文剛，饒寶，等.豬偽狂犬病疫苗的研究進展[J].江西農業學報，2010，22（3）：154-157.

（編輯：富春妮）

飲食對腸道細菌有重大影響

【美國每日科學網站4月28日報道】題：生活方式對腸道細菌有重大影響，腸道細菌又對健康有重大影響

吃吃喝喝影響著腸道細菌，可能對健康產生影響。荷蘭格羅寧根大學/格羅寧根大學醫學中心遺傳學家西絲卡·韋門加在研究了食物和藥物對人體腸道內細菌多樣性的影響后得出了這個結論。該研究刊登在美國《科學》周刊上。

在這項研究中，研究人員采集了1 100余名“生命線”項目參與者的大便樣本。該項目旨在監控荷蘭北部16.5萬名居民的健康狀況。這些樣本被用來分析腸道中細菌和其他微生物的DNA。除大便外，該研究還收集了參與者的飲食、用藥和健康狀況等信息。

這項研究的獨特之處在于它著眼于普通人群，而以前的研究往往著眼于特定疾病的患者。此外，該研究涵蓋的人群特別大并詳細研究了他們的腸道DNA。

韋門加表示：“研究人員通常只剖析DNA中能區分不同菌種的一個特定區域。我們則繪制了完整的細菌DNA，以獲得有關細菌類型的更詳細信息。”

這種DNA分析有可能探究是哪些因素影響著微生物組（我們每個人的腸道細菌群落都是與眾不同的）的多樣性。

影響因素似乎很多。韋門加說：“比如，飲食會在腸道起作用。”

經常喝酸奶或脫脂乳的人擁有更加多樣的腸道細菌。咖啡和葡萄酒也能增加多樣性，全脂牛奶和高熱量飲食則會使之減輕。

格羅寧根大學醫學中心研究員、該研究論文第一作者亞歷山德拉·熱爾納科娃說：“我們共發現了60個對多樣性有影響的飲食因素，它們的確切影響還很難說。但多樣性和健康之間確有相關性：越多樣越好。”

此外，至少有19種藥物—其中有些是廣泛使用的—對微生物組的多樣性有影響。該校研究人員先前的研究已經證明抗酸劑會減少多樣性，而抗生素和糖尿病藥物二甲雙胍也有影響。

韋門加強調，這些都是重大發現，“疾病往往由多種因素引起，其中大部分因素是無法改變的，比如基因和年齡。但你可以通過調整飲食和用藥來改變微生物組的多樣性。一旦我們明白了其中的道理，那就會帶來新的可能性。”

近來的研究證實了這一點的重要性。現在已經可以通過“糞菌移植”來治療肥胖癥，也就是把瘦人的腸道細菌植入肥胖患者的腸道。適當的飲食或特定的藥物也許可以產生相同的效果。

目前，有關微生物組的研究很多，但這些研究往往看起來很難復制。因此，令人驚嘆的是，同一期《科學》周刊刊登的比利時研究團隊的研究結果與格羅寧根研究團隊的結論有大約80%的一致率。

韋門加表示：“關鍵在于進行研究的方式。”很重要的一點是，大便樣本由參與者自己速凍，并且研究人員收集時仍處于冷凍狀態。“樣本往往通過郵寄方式送達。如果那樣的話，就會接觸氧氣和高溫，而細菌在這些條件下是無法存活的。因此，《科學》周刊上這兩篇論文為這個領域今后的研究確立了一個新標準。”

（轉自參考消息[N]，2016-05-03）

S858.28

A

1002-1957(2016)03-0113-04

2016-04-12

長江學者發展計劃（IRT13083）；四川省科技成果轉化項目（2013NC0014）

楊凡（1992-），男，四川南充人，在讀碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究.E-mail:abtcyf@126.com

徐志文，教授，主要從事動物傳染病病原分子生物學研究.E-mail:abtcxzw@126.com