豬鏈球菌感染病原的分離鑒定及藥敏試驗

李萍，樊毅，毛汐語，殷玥，趙軍，徐志文，2，朱玲，2

（1.四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

豬鏈球菌感染病原的分離鑒定及藥敏試驗

李萍1，樊毅1，毛汐語1，殷玥1，趙軍1，徐志文1，2，朱玲1，2

（1.四川農業大學動物醫學院動物生物技術中心，四川成都611130；2.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川成都611130）

2016年3月，四川省南充市某規模化養豬場仔豬出現被毛粗亂、眼瞼水腫、關節腫大、呼吸困難等癥狀，隨即大量死亡。剖檢可見心包腔積液，肝臟表面有大量白色纖維素性滲出物，并與胸膜、腹膜粘連。使用氟苯尼考、恩諾沙星治療無效。根據臨床癥狀、剖檢病理變化及抗生素使用情況可初步判斷主要病原為豬鏈球菌。無菌采集心包積液、關節積液、肺臟及脾臟進行細菌的分離鑒定，并將分離菌株進行常規抗生素藥物敏感性試驗以指導豬場科學用藥，有效控制疫情。

1 材料與方法

1.1 病料來源

無菌采集疑似感染豬鏈球菌的病豬心包積液、關節積液、肺臟及脾臟。

1.2 試驗試劑和試驗動物

主要培養基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）等購自青島日水生物技術有限公司，兔鮮血瓊脂培養基自行配制。

生化試劑微量發酵管：葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、菊糖、棉籽糖、水楊苷、明膠、吲哚、枸櫞酸鈉等均購自杭州微生物試劑有限公司。

藥敏紙片：氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、丁胺卡那霉素、四環素、林可霉素、環丙氟哌酸、阿莫西林、苯唑西林、氨芐西林、頭孢噻肟及頭孢氨芐共12種藥敏紙片（直徑6 mm），均購自杭州天和微生物試劑有限公司。

試驗動物：20 g/只健康小鼠，購自四川農業大學。

1.3 直接染色鏡檢

取病豬的肺、脾、心包積液及關節積液進行革蘭氏染色，鏡檢。

1.4 細菌的分離培養

用燃燒的酒精棉球將送檢病料進行表面消毒，將剪刀和鑷子消毒冷卻后剪取病料病變與健康區域交界處的深層組織，劃線接種于兔鮮血瓊脂培養基及TSA培養基，置37℃恒溫箱中培養24～36 h。觀察菌落形態，挑取單個針尖大小、半透明且邊緣整齊的菌落劃線接種于TSA培養基進行分離純化培養，置37℃恒溫箱中培養12～24 h后，置4℃保存，待鑒定。

1.5 細菌的鑒定

1.5.1 細菌形態觀察將上述純培養物進行革蘭氏染色，通過染色鏡檢，對可疑菌進行初步判斷。

1.5.2 生化鑒定挑取純培養物的單個菌落，分別接種于蔗糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖等生化微量發酵管中，培養24～48 h后觀察結果。

1.5.3 核酸檢測將分離得到的可疑菌用16S rRNA通用引物27F/1492R進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳后將PCR產物送往上海生工公司測序。將測得序列與GenBank數據庫中已發表菌株序列進行比對，從核酸角度對病原做出最終診斷，并分析其與不同菌株的同源性。

1.6 生物學特性測定

1.6.1 致病性試驗將細菌純培養物挑取單個菌落接種到TSB肉湯中，37℃恒溫培養8～12 h。取菌液按0.2 mL/只劑量腹腔注射接種5只健康小鼠，接種后正常飼喂，觀察其精神狀態及死亡狀況。并在小鼠死亡1 h內無菌取其肺及心臟等接種兔鮮血瓊脂培養基以驗證并回收病原菌。另取5只健康小鼠接種等量TSB肉湯作為空白對照。

1.6.2 藥敏試驗采用常規藥敏紙片法測定分離菌株對臨床常用抗生素的敏感性。取上述TSB肉湯純培養產物100 μL，用L形玻璃棒均勻涂布于TSA培養基表面，室溫放置10 min，待菌體固定后，用無菌鑷子夾取選用的藥敏紙片緊貼于瓊脂表面，置于37℃恒溫箱中培養24～36 h，測量抑菌圈的直徑，判斷分離菌株的耐藥性。

2 結果

2.1 直接染色鏡檢

通過對病變組織的革蘭氏染色，可見組織間主要分布有一種革蘭氏陽性菌，菌體呈球形或卵圓形，多成對存在，部分呈較短的鏈狀排列。

2.2 細菌的培養特性

挑取單個菌落劃線接種于TSA培養基及兔鮮血瓊脂培養基，置于37℃溫箱中培養24～36 h后，TSA培養基上可見菌落呈單個針尖大小的灰白色半透明菌，兔鮮血瓊脂培養基上可見與TSA培養基上相似且呈α溶血的菌落。

2.3 純培養物染色鏡檢

將TSA培養基及兔鮮血瓊脂培養基上的純培養物進行革蘭氏染色鏡檢，可見排列成鏈狀的陽性球菌（圖1），初步判斷為鏈球菌。

圖1 純培養物染色鏡檢（400倍）

2.4 生化鑒定結果

挑取TSA培養基及兔鮮血瓊脂培養基上的純培養物進行生化鑒定，結果如表1。根據分離菌株的培養特性、染色鏡檢形態以及生化鑒定結果可初步判斷為豬鏈球菌。

表1 生化鑒定結果

2.5 核酸檢測結果

通過PCR擴增成功得到1 500 bp左右的目的條帶（圖2），將測得序列與NCBI上已發表序列通過BLAST比對可判斷該菌株為豬鏈球菌，該序列與CP003993.1、AB071339.1、AB071340.1、AB071340.1、AF009506.1、HM590020.1、JQ975903.1等同源性均為99%。

2.6 致病性試驗

5只健康小鼠在接種后12 h左右即表現精神沉郁、行動緩慢、被毛粗亂等癥狀，在接種18 h后開始出現死亡，36 h后全部死亡。對照組小鼠無異常反應。及時剖檢死亡小鼠可見肝臟、腎臟腫大充血，肺充血。取上述組織無菌涂布于兔鮮血瓊脂培養基中，37℃培養12～24 h后，培養基上生長出較均一的菌落，染色鏡檢與鏈球菌相一致，表明該菌株具有較強的致病力。

圖2 PCR擴增結果

2.7 藥敏試驗結果

對分離豬鏈球菌進行藥敏試驗，結果顯示，該菌對阿莫西林、氨芐西林、頭孢噻肟及頭孢氨芐敏感，對其余8種受試抗生素均表現耐藥（表2）。

表2 藥敏試驗結果

3 討論

豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患急性、熱性傳染病，嚴重威脅著公共衛生安全。該病主要表現為急性出血性敗血癥、腦膜炎、關節炎、心內膜炎、肺炎、淋巴結化膿、哺乳仔豬下痢和孕豬流產等癥狀，具有較高的發病率和死亡率，呈世界范圍流行。該病可通過呼吸道、生殖道和消化道傳播，也可經皮膚、黏膜創傷感染，同時還可經母豬分娩傳染給仔豬。傳播方式的多樣性對飼養管理條件提出了嚴苛要求。細菌性疾病往往表現為混合感染，豬鏈球菌感染發病癥狀與副豬嗜血桿菌具有一定的相似性，均會表現呼吸困難、關節腫脹等臨床癥狀，病理剖檢均可見肺臟、肝臟損傷及心包積液、纖維素性滲出物，且常表現為混合感染；二者在抗生素耐藥譜上具有較大差異，為疫病的治療與防控帶來困難。因而對病原的準確判斷需要進行較完善的鑒定分析。

根據對病原的分離及進一步鑒定可確診該病例為豬鏈球菌感染。且該分離株具有較強的致病性，對臨床常用抗生素氟苯尼考、恩諾沙星、強力霉素、丁胺卡那霉素、四環素、林可霉素、環丙氟哌酸及苯唑西林表現耐藥，而對多數β-內酰胺類及頭孢類抗生素表現較為敏感。針對該病的治療，早期常用抗生素包括四環素類、大環內酯類、β-內酰胺類及頭孢類等，由于抗生素的長期使用，四環素類、大環內酯類及氟喹諾酮類抗生素已經出現較嚴重的耐藥現象[1-3]，給臨床防治該病帶來了難度。目前常見的細菌耐藥機制主要包括：細菌整合子系統，通過捕獲外源抗性基因并接合質粒使之在細菌間傳播；產生滅活酶或鈍化酶破壞抗生素結構使之失去作用[4]；降低細菌外膜通透性，使抗生素不易進入靶位點[5]；生物被膜（菌膜）的物理屏障及細菌群體感應作用，前者通過黏性胞外基質抵御抗生素進入[6]，后者通過激活細菌群體感應協同完成感染[7]；改變抗生素作用靶位點結構，降低細菌細胞的親和力；產生能量依賴性主動外排蛋白，將進入菌體的抗生素泵出體外等。細菌耐藥機制復雜多樣，其進化速度遠快于抗生素的研發速度，對于畜禽養殖及醫療衛生的威脅可想而知。因此，在合理使用抗生素的同時，還需加強各地細菌耐藥情況的監測，掌握細菌耐藥情況對于擬定控制措施具有重要作用。

[1]李英霞，郭大偉，李洪恩，等.紅霉素與四環素耐藥基因在豬鏈球菌臨床分離株中的檢測[J].畜牧與獸醫，2009，41（10）：13-17.

[2]陳磊，宋婭靜，吳超，等.豬鏈球菌耐藥性及對四環素和紅霉素抗生素耐藥機制研究[C]//第14屆全國規模化豬場主要疫病監控與凈化專題研討會文集.武漢：2013：133-135.

[3]芮萍，馬增軍，段玲欣，等.豬鏈球菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥性與靶位突變相關性[J].畜牧獸醫學報，2011，42（4）：600-604.

[4]劉鋼.革蘭陰性桿菌耐藥機制及治療對策[J].北京醫學，2012，34（3）：197-198.

[5]Cui L,Murakami H,Kuwahara-Arai K,et al.Contribution of a thickened cell wall and its glutamine nonamidated component to the vancomycin resistance expressed by Staphylococcus aureus Mu50[J].Antimicrobial Agents&Chemotherapy,2000,44(9): 2276-2285.

[6]李建華，宋豐貴.細菌生物膜形成與細菌耐藥機制研究進展[J].中國新藥與臨床雜志，2008，27（1）：70-74.

[7]de Kievit T R,Iglewski B H.Bacterial quorum sensing in pathogenic relationships[J].Infection&Immunity,2000,68(9): 4839-4849.

（編輯：富春妮）

S858.282.61+1

A

1002-1957(2016)03-0108-03

2016-04-24

四川省科技支撐計劃（2014NZ0043）

李萍（1990-），女，四川眉山人，在讀碩士研究生，主要從事病原分子生物學研究.E-mail:lipinga104@163.com

朱玲，教授，博士，主要從事病原分子生物學研究. E-mail:abtczl@126.com