藏豬和杜洛克豬IGF-2基因表達差異及其與肉質性狀相關性分析

陶璇，顧以韌，梁艷，楊雪梅，鐘志君，陳曉暉，楊躍奎，曾凱，呂學斌

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066）

藏豬和杜洛克豬IGF-2基因表達差異及其與肉質性狀相關性分析

陶璇1，2，顧以韌1，2，梁艷1，2，楊雪梅1，2，鐘志君1，2，陳曉暉1，2，楊躍奎1，2，曾凱1，2，呂學斌1，2

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都610066）

為了揭示脂肪型的藏豬和瘦肉型的杜洛克豬胰島素樣生長因子2（IGF-2）基因的表達差異，采用QRT-PCR方法檢測了兩豬種背最長肌中IGF-2基因在180日齡的表達差異，并分析其與肌纖維面積、肌內脂肪（IMF）含量的相關性。結果表明，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達量顯著低于杜洛克豬（P<0.05）。相關性分析結果顯示，IGF-2 mRNA表達量與肌纖維面積呈顯著正相關（P<0.05），與IMF含量呈顯著負相關（P<0.05）。以上結果初步揭示了兩豬種在180日齡IGF-2基因表達的品種差異，為深入研究肌纖維生長及IMF沉積的調控機制提供了基礎數據。

豬；背最長肌；熒光定量PCR；IGF-2基因；肌纖維面積；肌內脂肪含量

胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor 2,IGF-2）作為胰島素樣生長因子家族成員之一，在胎兒生長發育、腫瘤細胞增殖、肌肉生長和基因組印跡等方面具有重要的調控作用，是影響豬胴體瘦肉率和背膘厚度的重要候選基因之一[1-3]。研究發現，向背膘更厚的遺傳選擇會提高血漿IGF-2濃度[4-5]。公豬在15～23周齡之間時，IGF-2濃度與背膘厚呈負相關[6]，預示IGF-2可能是調節脂肪沉積的主要因子之一。

本研究以選育程度低、瘦肉率低的藏豬和選育程度高、瘦肉率高的杜洛克豬為研究對象，采用熒光定量PCR（QRT-PCR）方法研究兩豬種180日齡時背最長肌中IGF-2 mRNA的表達差異及其與肉質性狀肌纖維面積（Cross sectional area of muscle fiber, CSA）和肌內脂肪（Intramuscular fat,IMF）含量的關系，為研究IGF-2基因影響肌纖維面積、IMF含量的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

試驗采用的藏豬、杜洛克豬均由四川省畜牧科學研究院科研試驗豬場提供。于2014年5月隨機挑選35日齡斷奶的藏豬、杜洛克豬各4頭，共計8頭組建群體，采用相同營養水平和飼喂方式，到180日齡時進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。采集倒數3～4肋骨間對應處的背最長肌樣品，一部分用于IMF含量測定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，隨后投入液氮中保存。

1.2 肉質性狀測定

1.2.1 肌纖維面積測定采用KD-2508型切片機（Kedee公司）按照冰凍切片標準制作流程制作背最長肌樣品的冰凍切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK5000型顯微成相系統（Optec公司）采集代表性區域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件計算每個樣品中100根肌纖維的面積。

1.2.2 肌內脂肪含量測定屠宰后采集倒數3～4肋骨間背最長肌樣品10 g左右，樣品處理和操作嚴格按照豬肌肉品質測定技術規范（NY/T 821—2004）進行，采用全自動快速索氏抽提儀（瑞士，Buchi）進行抽提。

1.3 QRT-PCR測定IGF-2 mRNA相對表達量

1.3.1 總RNA提取和反轉錄肌肉樣品的總RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）試劑盒的操作說明書完成，并通過Agilent Bioanalyzer 2100對抽提的RNA進行質檢，然后使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）進行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的設計與合成引物由Primer premier 5.0程序設計，深圳華大基因科技有限公司合成，信息見表1。

表1 熒光定量RT-PCR目的基因引物的相關信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad,USA）儀器上進行mRNA熒光定量PCR檢測。PCR反應體系為25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用兩步法進行熒光定量PCR的擴增。PCR循環參數為：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循環40次，PCR擴增后進行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 s的速率從55.0℃緩慢遞增到95.0℃。試驗樣本和陰性對照每個樣本重復3次。

1.4 統計與分析

選用肌肉組織中穩定表達的ACTB、TBP和TOP2B為看家基因，運用GeNorm軟件計算出看家基因的歸一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷貝數（最大拷貝數設為1）與對應樣品的NF值的比值表示基因mRNA的相對表達量[7]。采用SigmaPlot 12.5軟件對性狀指標和基因相對表達量進行t檢驗，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 肌纖維面積、IMF含量測定

由表2可知，180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積分別為2 221.52、6 351.41 μm2，IMF含量分別為3.08%、2.46%。藏豬肌纖維面積極顯著小于杜洛克豬4 129.89 μm2（P<0.01），IMF含量極顯著高于杜洛克豬0.62個百分點（P<0.01）。

表2 180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積、IMF含量（n=4）

2.2 IGF-2 mRNA表達量及其與肌纖維面積、IMF含量相關性分析

由圖1可知，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達量顯著低于杜洛克豬（P<0.05）。對IGF-2 mRNA表達量與肉質性狀肌纖維面積、IMF含量的相關性進行分析，結果見表3。IGF-2 mRNA表達量與肌纖維面積呈顯著正相關（P<0.05），與IMF含量呈顯著負相關（P<0.05）。

圖1 6月齡藏豬與杜洛克豬IGF-2基因相對表達量

表3 IGF-2 mRNA表達量與肌纖維面積、IMF含量相關性分析

3 討論

藏豬是國家級畜禽資源保護品種，IMF含量較高，肉質優良，但生長速度慢，胴體瘦肉率低，屬脂肪型豬種；而杜洛克豬IMF含量較低，肉質較差，但生長發育快，飼料利用率高，胴體瘦肉率高，是典型的瘦肉型豬種。本研究結果顯示，180日齡藏豬IMF含量極顯著高于杜洛克豬（P<0.01），而肌纖維面積極顯著低于杜洛克豬（P<0.01），這與藏豬和杜洛克豬的種質特性相一致。

IGF-2具有提高蛋白質合成中氨基酸的利用率并抑制蛋白質降解，從而促進骨細胞和肌肉細胞增殖的作用。研究證明，IGF-2基因對豬肌纖維發育、生長及脂肪的沉積有重要影響，進而影響生長速度、瘦肉率、背膘厚、背最長肌面積[8-12]。本研究結果顯示，180日齡藏豬IGF-2 mRNA表達量顯著低于杜洛克豬（P<0.05），與肌纖維面積呈顯著正相關（P< 0.05），與IMF含量呈顯著負相關（P<0.05），說明IGF-2基因能促進肌纖維生長、降低肌內脂肪沉積，與之前報道基本一致。

[1]Florini J R,Magri K A,Ewton D Z,et al."Spontaneous"differentiation of skeletal myoblast is dependent upon autocrine secretion of insulin-like growth factor-II[J].Journal of Biological Chemistry,1991,266:15917-15923.

[2]劉桂蘭，蔣思文，熊遠著，等.胰島素樣生長因子2的遺傳學特征與生物學作用[J].遺傳，2002，24（2）：211-213.

[3]吳嫦麗，許繼國，吳同山，等.長白和藍塘豬印記基因IGF2和H19的時空表達研究[J].華南農業大學學報，2013，34（3）：388-392.

[4]Lamberson W R,Sterle J A,Matteri R L.Relationships of serum insulin-like growth f actor-II concent rations to growth, compositional,and reproductive traits of swine[J].Journal of Animal Science,1996,74:1753-1756.

[5]Sterle J A,Cantley T C,Lamberson W R,et al.Effects of recombinant porcine somatotropin on placental size,fetal growth, and IGF-I and IGF-II concentrations in pigs[J].Journal of Animal Science,1995,73:2980-2985.

[6]Owens P C,Gatford K L,Walton P E,et al.The relationship between endogenous insulin-like growth factors and growth in pigs[J].Journal of Animal Science,1999,77(8):2098-2103.

[7]Erkens T,Poucke M V,Vandesompele J,et al.Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RTPCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle,and evaluation with PPARGC1A[J].Bmc Biotechnology,2006,6(1): 41.

[8]Annemieke P,Rattink D J,De K,et al.Fine mapping and imprinting analysis for fatness trait QTLs in pigs[J].Mammalian Genome,2000,11(8):656-661.

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[10]Vykoukalova Z,Knoll A,Dvorak J,et al.New SNPs in the IGF2 gene and association between this gene and backfat thickness and lean meat content in Large White pigs[J].Journal of animal breeding and genetics,2006,123(3):204-207.

[11]虞德兵，何宗亮，張偉峰，等.豬IGF-2基因內含子3變異的遺傳效應分析[J].遺傳，2008，30（1）：87-93.

[12]虞德兵，熊鍇，張宇霞，等.豬IGF2 Intron3 G3072A突變及其在背最長肌中差異表達[J].南京農業大學學報，2010，33（6）：105-109.

（編輯：郭玉翠）

吃素未必有利于環境

【英國《每日郵報》網站12月15日報道】堅持素食未必像你以為的那么有利于環境，事實上，它也許對環境有破壞。

卡內基-梅隆大學的一項研究發現，與某些肉類相比，許多常見蔬菜每卡路里熱量需要消耗更多資源，還造成更多的溫室氣體排放。

雖然研究證實降低體重對環境有積極影響，但研究人員發現，健康的飲食會對環境產生更大影響。

他們研究了食品在從種植、加工和運輸到銷售、服務和家庭存儲的過程中所產生的影響。

研究人員還測量了能源消耗量、藍色水足跡（水足跡指的是國家、地區或個人在一定時間內消費的產品和服務耗費的水資源，藍色水足跡指耗費的藍水資源，藍水指河流、湖泊、水庫、池塘等地表或地下水資源—本報注）和溫室氣體排放量。

“吃生菜的溫室氣體排放量是吃培根的三倍，”社會和決策學與工程和公共政策教授保羅·菲什貝克說，“許多常見蔬菜每卡路里熱量所需要的資源超過你的想象。與豬肉或雞肉相比，茄子、芹菜和黃瓜顯得特別糟糕。”

研究人員研究了食品供應鏈，以了解美國的肥胖癥與環境的關系。

攝入較少熱量和降低體重能減少能源使用量，并使淡水消耗量和溫室氣體排放量下降9%。

然而，吃得更健康反而加大了對環境的影響。水果、蔬菜、乳制品和海產品造成能源使用量增加38%，同時導致用水量增加10%、溫室氣體排放量增加6%。

湯姆說：“飲食和環境之間關系復雜，對健康有利的未必有利于環境。政府官員認識到這點很重要，他們將來擬訂膳食指南時應牢記這些相互關系。”

（轉自參考消息[N]，2015-12-18）

Expression Differences of IGF-2 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAOXuan1，2,GUYiren1，2,LIANGYan1，2,YANGXuemei1，2,ZHONGZhijun1，2, CHENXiaohui1，2,YANGYuekui1，2,ZENGKai1，2,LVXuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China; 2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Insulin-like growth factor 2(IGF-2)gene between Tibet (a fatty,indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations with cross sectional area of muscle fiber(CSA)and intramuscular fat(IMF)content were also analyzed.The results showed that the expression level of IGF-2 mRNA in Tibet pigs was significantly lower than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P<0.05).The correlation analysis results showed that the expression level of IGF-2 mRNA had significant positive correlation with CSA(P<0.05)and significant negative correlation with IMF content(P<0.05).These results suggested that the mRNA level of IGF-2 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and IMF deposition.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;IGF-2 gene;cross sectional area of muscle fiber;IMF content

S828

A

1002-1957(2016)03-0062-03

2016-04-28

四川省基本科研業務費專項資金（SASA2014A04）；國家生豬產業技術體系-綜合試驗站（CARS-36）；四川省科技支撐計劃（2014NZ0092）；國家現代農業產業技術體系四川創新團隊（sccxtd-001）；四川省基本科研業務費專項資金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究.E-mail：taoxuan0106@163.com

呂學斌（1965-），男，研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究.E-mail：lvxuebin@21cn.com