豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒與豬流行性腹瀉病毒混合感染的診斷

焦文強(qiáng)，徐引弟，王克領(lǐng)，朱文豪，許峰，白獻(xiàn)曉

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002）

豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒與豬流行性腹瀉病毒混合感染的診斷

焦文強(qiáng)，徐引弟，王克領(lǐng)，朱文豪，許峰，白獻(xiàn)曉

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州450002）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染引起的一種豬烈性傳染病，各種年齡的豬均可感染，但病情和臨床癥狀差異顯著，主要表現(xiàn)為母豬高燒以及繁殖障礙，產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱仔等，仔豬主要表現(xiàn)為呼吸道病癥狀，死亡率可達(dá)100%[1]。該病最早由荷蘭學(xué)者在1987年報道[2]，并于1991年由荷蘭學(xué)者首先分離報道，并將毒株命名為Lelystad Virus（LV），隨后美國科學(xué)家也成功分離到此病毒，命名為ATCC VR-2332[3]。LV和VR-2332毒株是PRRSV兩個基因型的代表性毒株。我國于1996年首次分離鑒定PRRS，確定了該病在我國確實存在[4]。2006年由PRRS經(jīng)典毒株突變株引起的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨額損失，是嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病之一[5-6]。

豬偽狂犬病（PR）是由偽狂犬病病毒（PRV）感染引起的一種急性接觸性傳染病，各年齡階段的豬均可感染，但是主要感染母豬和小豬。臨床表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎，小豬表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率80%～100%不等[7-8]。耐過豬有時表現(xiàn)為一過性發(fā)燒、咳嗽等，但可長期帶毒，成為該病的傳染源，造成持續(xù)性感染。

豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染引起的一種以仔豬腹瀉為特征的烈性傳染病。臨床主要表現(xiàn)為腹瀉，且伴隨有嘔吐，糞便呈黃色或綠色水樣，有時夾雜有未消化的凝乳塊，病程一般1周以內(nèi)，病豬因嚴(yán)重脫水而死亡。

1 材料與方法

1.1 病料采集

2016年3月，河南省駐馬店某豬場發(fā)生疫情，臨床癥狀主要表現(xiàn)為7日齡左右仔豬發(fā)燒、咳嗽、呼吸頻率加快、神經(jīng)癥狀以及嚴(yán)重腹瀉，脫水，發(fā)病率達(dá)到100%，死亡率約為60%。剖檢可見病豬全身淋巴結(jié)腫大，出血，腸道變薄，呈透明狀；肺臟有出血斑，水腫；腦組織充血嚴(yán)重。通過臨床癥狀和剖檢病理變化分析，結(jié)合本地區(qū)流行病學(xué)研究，初步判斷為豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病和豬流行性腹瀉混合感染。在無菌條件下，分別挑選病變較為典型的豬腦組織、肺臟和空腸，原始編號后進(jìn)行實驗室診斷。實驗室診斷于2016年3月10—12日在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)診斷室進(jìn)行。

1.2 試劑

Taq DNA聚合酶、RNA提取試劑盒、DNA提取試劑盒、DL 2 000 Marker、MLV反轉(zhuǎn)錄酶以及RNA酶抑制劑購自于寶生物工程（大連）有限公司，其它試劑均為分析醇。

1.3 引物合成

根據(jù)GenBank發(fā)布的PRRSV、PRV和PEDV序列，經(jīng)DNA Man進(jìn)行比對后，選擇核苷酸保守區(qū)，使用生物學(xué)軟件Primer 5.0進(jìn)行引物設(shè)計，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒總RNA的提取及PCR擴(kuò)增

按照寶生物工程（大連）有限公司RNA提取試劑盒操作說明提取病毒總RNA，提取后的RNA隨即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系如下：2×buffer 2 μL，dNTP 2 μL，隨機(jī)引物0.3 μL，RNA酶抑制劑0.3 μL，MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，RNA 4.9 μL，共10 μL。混合均勻后置于42℃水浴1 h，然后放置70℃水浴滅活10 min后放4℃冰箱冷卻15min后配制PCR反應(yīng)體系：2×PCR buffer 2.5 μL，dNTP 4 μL，上、下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，cDNA 5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)體系如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。PRRSV預(yù)期大小片段為508 bp，PEDV預(yù)期大小片段為756 bp。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.5 病毒總DNA的提取與PCR擴(kuò)增

按照寶生物工程（大連）有限公司DNA提取試劑盒操作說明提取病毒總DNA，提取后的DNA立即進(jìn)行PCR反應(yīng)，體系如下：DNA 5 μL，上、下游引物各1μL，Taq DNA聚合酶0.5 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足25 μL；反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后72℃延伸10 min。PRV預(yù)期大小為325 bp。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。1.6PRRSV NSP2基因、PEDV ORF3基因以及PRV基因序列測定

根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳中結(jié)果判定，該豬場為PRRSV、PRV以及PEDV陽性。將符合預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。

2 結(jié)果

2.1 臨床癥狀

發(fā)病仔豬體溫41.5～42℃，呼吸急促，腹式呼吸明顯；病豬食欲廢絕，精神沉郁，扎堆，拉黃色、綠色稀糞，糞便中夾雜有小塊未消化的凝乳塊，嘔吐；病豬眼瞼腫脹明顯，呈原地轉(zhuǎn)圈運(yùn)動或者犬坐姿勢。

2.2 剖檢病變

剖檢可見腎臟有多量針尖大小出血點，肺臟有不規(guī)則的出血斑，水腫，小葉間隙明顯；腸壁變薄，呈透明狀，腸道中夾雜有少量黃色稀糞和未消化凝乳塊。

2.3 病原學(xué)檢測結(jié)果

結(jié)合臨床癥狀和剖檢結(jié)果，進(jìn)行了PRRSV、PRV和PEDV實驗室檢測。檢測結(jié)果顯示，PRRSV、PEDV、PRV均為陽性，見圖1—圖3。

圖1 PRRSV電泳結(jié)果

圖3 PRV電泳結(jié)果

2.4 序列分析

使用該研究中得到的PRRSV ORF5的序列與國內(nèi)分離株進(jìn)行比對，本研究得到的序列與其它分離株的相似性在85.2%～98.8%（圖4），證實PRRSV病毒變異較快，現(xiàn)有疫苗需要根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果及時更新疫苗毒株，這樣才可保證疫苗的保護(hù)力。使用本次研究得到的序列與其它參考毒株建立的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，ZMDBYSDZ株與HENAN-XINXX和HENAN-XINX兩株序列最為接近，與其它河南分離株遺傳進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5）。

圖4 駐馬店株與參考毒株的遺傳距離（ZMDBYSDZ為本次獲得毒株）

圖5 駐馬店株與參考毒株遺傳進(jìn)化樹（ZMDBYSDZ為本次獲得毒株）

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒和豬流行性腹瀉病毒是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的烈性傳染病，前兩種病主要引起母豬繁殖障礙、小豬呼吸道病癥狀以及神經(jīng)癥狀，后一種病主要引起1周齡以內(nèi)，特別是3日齡內(nèi)仔豬頑固性腹瀉。目前針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬偽狂犬病病毒以及豬流行性腹瀉病毒均有商品化疫苗，但是在養(yǎng)豬生產(chǎn)中PRRS和PR還是偶然發(fā)生，而冬春季節(jié)氣溫驟降為PED發(fā)生創(chuàng)造了條件。

基因序列分析表明，本次獲得的PRRSV ORF5序列與HENAN-XINXX和HENAN-XINX最為接近。ORF5基因是PRRSV中變異最大的結(jié)構(gòu)基因，本研究得到的ORF5序列與其它分離株的相似性在85.2%～98.8%；從系統(tǒng)進(jìn)化樹分析本次試驗得到的毒株屬于北美型毒株，且與PRRSV河南分離株親緣關(guān)系較為接近。該豬場在發(fā)病前就是PEDV、PRRSV和PRV陽性場，但是一直生產(chǎn)穩(wěn)定，由于冷空氣導(dǎo)致氣溫驟降，加上豬場保溫措施不到位，應(yīng)激導(dǎo)致PED發(fā)生，豬只抵抗力下降，進(jìn)而誘發(fā)PRRS和PR。

當(dāng)前，規(guī)模化豬場管理日益規(guī)范，專職獸醫(yī)根據(jù)本場疫病的具體情況和抗體監(jiān)測水平制定出針對本場的免疫程序，并定期化驗主要疫病抗體滴度了解豬場免疫情況，根據(jù)抗體水平調(diào)整免疫程序，加上嚴(yán)格的生物安全措施，豬場大規(guī)模疫病應(yīng)能得到及時控制。但是目前各種烈性病毒性疾病還時有發(fā)生，主要原因在于烈性傳染病病原較為復(fù)雜，不同血清型、不同基因型的疫苗缺乏交叉保護(hù)力；其次豬場相關(guān)制度執(zhí)行不到位，特別是生物安全措施，很多養(yǎng)殖場消毒通道、日常消毒、滅鼠等工作形同虛設(shè)，造成豬舍環(huán)境差，病原微生物不能得到及時清除，造成豬只抵抗力下降。豬場應(yīng)把“預(yù)防為主”作為疫病防控的首要前提，同時加以嚴(yán)格的生物安全措施，并認(rèn)真執(zhí)行到位，嚴(yán)格阻止病原微生物進(jìn)入豬場以及防止其在豬場內(nèi)的傳播。針對發(fā)病豬只要做到“早診斷、早治療”，定期對養(yǎng)豬場內(nèi)的病原微生物進(jìn)行分離，了解病原微生物類型，并進(jìn)行藥敏試驗，選擇最敏感的藥物進(jìn)行治療，防止出現(xiàn)抗生素濫用現(xiàn)象。

[1]Neumann E J,Kliebenstein J B,Johnson C D,et al.Assessment of the economic impact of porcine reproductive and respiratory syndrome on swine production in the United States[J].J Am Vet Med,2005,227(3):385-392.

[2]Wensvoort G,Terpstra C,Pol J M,et al.Mystery swine diseases in Netherlands:the isolation of Lelystad virus[J].Vet Q, 1991,13(3):121-130.

[3]Collins J E,Benfield D,Christianson W T,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus(isolate ATCC VR-2332) in North America and experimental reproduction of disease in gnotobiotic pig[J].J Vet Diagn Invest,1992,4(2):117-126.

[4]郭寶清，陳章水，劉文興，等.從疑似PRRS流產(chǎn)胎兒分離PRRSV的研究[J].中國畜禽傳染病，1996（2）：1-5.

[5]Tian K,Yu X,Zhao T,et al.Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of unique hallmark[J].Plos One,2007,2(6):e526.

[6]Tong G Z,Zhou Y J,Hao X F,et al.Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome,China[J].Emerg Infect Dis, 2007,13(9):1434-1436.

[7]Pomeranz L E,Reynolds A E,Hengartner C J.Molecular biology of pseudorabies virus:impact on neurovirology and veterinary medicine[J].Microbiol Mol Biol Rev,2005,69(3):462-500.

[8]Klupp B G,Lomniczi B,Visser N,et al.Mutations affecting the UL21 gene contribute to avirulence of pseudorabies virus vaccine strain Bartha[J].Virology,1995,212(2):466-473.

（編輯：富春妮）

睡眠的作用也許是掃垃圾

睡眠有多種重要功能，比如支持免疫系統(tǒng)、鞏固記憶等，但是，科學(xué)家們也一直在尋找睡眠的核心功能，也就是所有物種睡眠的共有功能。

最近，《科學(xué)》雜志發(fā)表了一篇文章，研究人員通過多種顏色標(biāo)記技術(shù)，對睡眠小鼠的大腦進(jìn)行了研究，得出的結(jié)論是，睡覺的根本作用是“清理大腦”。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在小鼠入睡之后，小鼠大腦里有一種轉(zhuǎn)運(yùn)通道網(wǎng)絡(luò)會充分?jǐn)U張，增幅達(dá)到60%，極大地提高了腦脊液的流量。這些高速通過的腦脊液會沖走β淀粉樣蛋白等代謝廢物。β淀粉樣蛋白會在大腦里形成淀粉樣斑塊，殺死腦細(xì)胞，與阿爾茨海默癥有關(guān)。

如果將來在其他的物種中發(fā)現(xiàn)了同樣的腦脊液清理機(jī)制，那么就可以說明大腦清理功能是睡眠的核心功能之一。

（轉(zhuǎn)自益壽文摘[J],2016（12）：15.）

S858.28

A

1002-1957(2016)04-0121-03

2016-05-16

河南省科技攻關(guān)項目（162102110050）

焦文強(qiáng)（1982-），男，河南新鄉(xiāng)人，助理研究員，博士，研究方向為分子病毒學(xué).E-mail:wenqiangjiao@163.com

白獻(xiàn)曉，研究員.E-mail:1030410210@qq.com