仔豬水腫病大腸桿菌O8型的分離與鑒定

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

仔豬水腫病大腸桿菌O8型的分離與鑒定

李天芝，于新友

（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600）

對山東東營某豬場送檢的病死豬進行病原菌分離，對分離細菌進行形態學觀察、生化試驗、PCR鑒定、藥敏試驗和動物致病性試驗。染色鏡檢、生化試驗結果及PCR試驗證實成功分離到一株O8型大腸桿菌，藥敏試驗結果證實該菌株具有多重耐藥性，致病性試驗中該菌株對昆明系小白鼠、仔豬均具有一定的致病性。

大腸桿菌；分離；鑒定

仔豬大腸桿菌病是由某些血清型大腸桿菌引起的腸道毒血癥，是由致病性大腸桿菌引起的豬常見傳染病，主要包括仔豬黃痢、仔豬白痢和豬水腫病[1-2]。豬水腫病多發于斷奶仔豬，尤其是生長快、體況健壯的仔豬最為常見，該病發病率不高，但病死率很高[3]，給養豬業造成很大損失[4]。2016年2月，山東東營某豬場斷奶仔豬四肢出現不能站立、共濟失調、倒地、四肢呈劃水狀運動等神經癥狀，眼瞼和頸部水腫。剖檢可見腸系膜水腫、胃壁呈膠凍樣水腫、腸系膜淋巴結呈串珠狀腫大、下頜淋巴結水腫、肺臟淤血水腫、膽囊水腫、腎包膜水腫。筆者無菌操作取病死豬的肝臟和腸系膜淋巴結進行分離鑒定，成功分離到一株O8型大腸桿菌，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑和試驗動物

無菌采取病死豬肝臟、腸系膜淋巴結等病料。草酸銨結晶紫、革蘭氏碘液、石炭酸復紅染液、血瓊脂平板、普通營養瓊脂平板、麥康凱營養瓊脂培養基和肉湯液體培養基均由山東綠都生物科技有限公司質檢部提供。DL 2 000 Marker、TagDNA聚合酶均購自寶生物工程（大連）有限公司。DNA回收試劑盒和質粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，藥敏紙片、糖發酵管及生化試驗用各種試劑購自杭州天和微生物試劑有限公司。大腸桿菌O型單價陽性標準血清購自中國獸醫藥品監察所。10只18～22 g清潔級昆明系小鼠購自山東省實驗動物中心，30日齡斷奶仔豬購自濱州周邊豬養殖戶。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的大腸桿菌16S rRNA基因序列，設計1對引物，上游引物：5′-TGGCGG ACGGGTGAGTAA-3′，下游引物：5′-CGTCATCCCCA CCTTCCTC-3′，擴增的基因序列為1 091 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細菌檢測與分離培養

將無菌采取的病死豬肝臟、腸系膜淋巴結病料涂片或觸片、干燥、固定，革蘭氏染色、鏡檢，觀察有無細菌及其形態特征，然后將病料劃線接種于血液瓊脂平板，37℃培養24 h，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢。挑取單個可疑菌落接種于普通肉湯培養基、麥康凱營養瓊脂培養基和營養瓊脂培養基上，37℃培養24 h，觀察生長情況，對可疑菌落進行涂片，革蘭氏染色鏡檢[5]。

1.4 生化鑒定

分別將分離菌經24 h營養瓊脂平板純培養后，進行糖發酵試驗及其他生化試驗。

1.5 PCR鑒定

挑取麥康凱營養瓊脂上單個菌落作為PCR的模板，進行PCR擴增。反應體系（50 μL）：10×Buffer（含氯化鎂）5 μL，上、下游引物各2 μL（20 pmol/L）。dNTP 4 μL，TagDNA聚合酶0.5 μL，模板1 μL，加水補足至50 μL。擴增反應程序：94℃5 min；94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，30個循環，72℃7 min。取5 μL PCR產物于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。回收PCR產物，連pMD18-T載體，轉化感受態DH5α，挑單菌落，振搖培養過夜，提取質粒，再次鑒定，將鑒定陽性的質粒送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.6 藥敏試驗

采用藥敏紙片瓊脂擴散法（Kirby-Bauer法）進行，方法如下：將分離菌18 h肉湯純培養物做10倍稀釋，用無菌棉簽均勻涂布于麥康凱營養瓊脂平板上。用無菌眼科鑷子將藥敏紙片輕輕緊貼于平板上，使紙片之間距離適當，置37℃培養16～18 h后觀察結果并測量抑菌圈直徑。

1.7 O抗原血清型鑒定

從麥康凱瓊脂平板上挑取單菌落，接種于肉湯培養基，37℃振蕩培養24 h，離心取沉淀，加入滅菌的0.5%石炭酸生理鹽水制成菌懸液，置于121℃下高壓2 h，作為待檢抗原，取制備的待檢抗原和大腸桿菌O抗血清各10 μL，在玻璃板上混勻，同時設生理鹽水對照，觀察并記錄反應結果，30 s內出現明顯凝集則判為陽性，否則為陰性。

1.8 致病性試驗

1.8.1 小白鼠致病性試驗將10只小鼠隨機分成2組，分別為試驗組和對照組，每組5只。試驗組取37℃24 h肉湯純培養物（含菌量9×108CFU/mL）腹腔注射接種18～22 g小白鼠，0.2 mL/只；對照組小白鼠腹腔注射肉湯0.2 mL/只。注射后小白鼠隔離飼養，觀察發病及死亡情況，并對死亡小白鼠進行細菌分離。

1.8.2 豬致病性試驗用上述菌液，選擇30日齡家豬6頭，平均分成2組，每組3頭，試驗組每只肌肉注射1.0 mL分離菌純肉湯培養物，對照組每只皮下注射1.0 mL無菌肉湯。隔離飼養，觀察豬發病及死亡情況，并對死亡豬肝臟、腸系膜淋巴結等涂片染色鏡檢，再次進行細菌分離。

2 結果與分析

2.1 細菌檢測與分離培養結果

腸系膜淋巴結、肝臟觸片革蘭氏染色鏡檢，可見兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。37℃培養24 h后，在血瓊脂平皿上有邊緣整齊、光滑、濕潤、半透明的圓形菌落生長。在麥康凱瓊脂培養基上為邊緣整齊、表面光滑、濕潤、圓形、桃紅色菌落。營養瓊脂培養基上也有圓形、半透明菌落，肉湯培養基呈均勻渾濁狀。分別挑取單個菌落和渾濁菌液涂片進行革蘭氏染色，鏡檢為中等大小、兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。

2.2 生化試驗結果

由表1可知，該分離株能發酵葡萄糖、麥芽糖、果糖、木糖、半乳糖、乳糖、鼠李糖、山梨醇，不能發酵肌醇、衛矛醇、赤鮮醇、菊糖，V-P試驗陰性，M-R試驗陽性，靛基質試驗陽性，氧化酶、尿素酶陰性，硫化氫試驗陰性，與大腸桿菌的生化特征一致。

表1 分離菌的生化試驗結果

2.3 PCR鑒定

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小為1 091 bp，與預期結果一致（圖1）。PCR產物與pMD18-T連接后，送公司測序。測序結果與GenBank登錄的大腸桿菌16S rRNA基因的相似性為100%。

圖1 大腸桿菌分離株PCR檢測結果

2.4 藥物敏感性試驗結果

由表2可知，分離菌對左氧氟沙星、頭孢曲松、新霉素、氟苯尼考高敏，對四環素、卡那霉素、環丙沙星中敏，對青霉素G、強力霉素、泰樂菌素、紅霉素、鏈霉素、氨芐西林、磺胺甲氧嘧啶耐藥。

表2 分離菌株的藥物敏感性試驗結果mm

2.5 血清型鑒定結果

玻片凝集試驗結果顯示，該菌的O抗原血清型為O8。

2.6 致病性試驗

2.6.1 小鼠致病性試驗試驗組小白鼠注射分離菌6 h后出現眼瞼、面部水腫、精神委靡、食欲不振，同時伴有共濟失調、麻痹等神經癥狀，48 h內全部死亡。剖檢小鼠肝臟和脾臟腫大、肺臟有點狀出血，胃壁和腸系膜漿液性水腫、腸黏膜出血。其他臟器未見明顯眼觀病變。取攻毒死亡小鼠肝臟和腸系膜淋巴結等劃線接種于麥康凱平板，涂片染色，鏡檢發現為革蘭氏陰性短小桿菌。對照組小白鼠未見異常。

2.6.2 家豬致病性試驗試驗組家豬攻毒后12 h可見精神委靡，豬眼瞼和頸部高度水腫、不能站立、呈劃水狀運動，剖檢可見胃壁水腫、尤其是胃大彎水腫嚴重，腸系膜水腫、全身淋巴結水腫，肺水腫、心臟水腫。4 d內全部死亡，取死亡豬腸系膜淋巴結、肝臟等分離細菌、涂片，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性短小桿菌。菌落PCR結果顯示，在1 091 bp左右有特異性條帶，說明從病變組織中分離到大腸桿菌。對照組家豬無任何臨床癥狀，剖檢發現各組織器官正常。

3 討論

選擇細菌性疾病病原分離時，要選擇有代表性的病例，并且最好是最近1周未經抗生素治療的病豬，無菌操作采樣，保證用于細菌分離的病料無人為污染，必須新鮮運送，保證整個過程病料始終處于低溫狀態。

由于養豬場長期用藥不規范及飼料中抗生素的大量添加，使豬大腸桿菌的抗藥性日益嚴重，給豬大腸桿菌病的治療造成很大的困難。藥敏試驗結果表明，該分離株對左氧氟沙星、頭孢曲松、新霉素、氟苯尼考高度敏感，因此，可選取這些藥物進行治療以提高療效，多種藥物交替、輪換使用，避免再次產生耐藥性。建議以后如果豬場有細菌病暴發，都要將細菌分離鑒定，并進行藥敏試驗，以便有針對性的用藥，使豬場損失降低。

對畜禽傳染病應該堅持防重于治的原則，以預防為主。豬大腸桿菌病也是如此，日常應加強飼養管理，注意防寒保暖，減少天氣變化、營養因素等外界條件對豬的影響，提高豬的抗病能力，同時做好消毒與滅蠅、滅蚊工作，保持豬場清潔衛生。大腸桿菌血清型眾多，對家豬致病的大腸桿菌血清型有O2、O8、O138、O139、O141等，各血清型之間交叉保護性效果不好。臨床中大腸桿菌優勢血清型具有一定的區域性，可以篩選優勢血清型且具有良好免疫原性的菌株制備多價苗進行免疫預防。

[1]劉峰，張進，劉毅.豬大腸桿菌病防治研究進展[J].湖南畜牧獸醫，2010（6）：1-3.

[2]吳文福，巫月生，賴月輝，等.豬大腸桿菌病的流行特點[J].廣東畜牧獸醫科技，2001，26（1）：13-15.

[3]謝金文，董林，苗立中，等.豬水腫病大腸桿菌的分離鑒定及其耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2011（3）：121-122.

[4]陳溥言.獸醫傳染病學[M].北京：中國農業出版社，2006：111-119.

[5]胡桂學.獸醫微生物學實驗教程[M].北京：中國農業大學出版社，2006：35-38.

（編輯：富春妮）

伸筋拉骨益壽延年

常言道：“筋長一寸，壽延十年。”我在練習氣功時，充分注意到了伸筋和拉骨。這樣做的好處是使全身舒展，又可以打通經絡。在《鶴翔莊氣功》中，第一節六方和合，兩手掌向上，兩手臂盡量向前伸展，這樣反復做3遍，接著做下一個動作，兩手臂回收，再向左右伸展，手掌還是向上，這一舉和一伸，都要伸展盡量充分，這樣就做到了伸筋和拉骨。當然，兩手臂在做回收和舒展時，要緊密地配合呼吸，呼吸要細、長、勻、緩。在一呼一吸中，練功者就吸收了天地中的精華，同時也排出了全身的廢氣。

同樣，在乒乓球運動中，我也著重練習伸筋拉骨的動作。例如，乒乓球運動的技術動作正拉弧圈球與直板橫打，最能說明問題。正接弧圈球與直板橫打的技術要領是用球拍的正上部擊球，要求吸球、拉球與發力一氣呵成，右臂盡量往上拉（小臂一定要超過肩的高度），這樣拉過去的球速度快、旋轉快，失誤也少。手臂盡量往上拉的過程就是伸筋拉骨的過程。運動中，拉動了手臂外側的小腸經，也拉動了手臂上的肺經、心經、大腸經和心包經，這些經絡都被打通了。這兩項技術在乒乓球運動中是使用頻率很高的技術，平均每分鐘要做四五次，打1個小時的乒乓球，大約要做200次。這200次的運動對手臂部位的各經絡進行了疏通和調理，就對消化、循環、泌尿、內分泌和呼吸系統起到了很好的調理作用。

（摘自《中老年保健》2015-12范良善/文）

Isolation and Identification of Escherichia coli Serotype O8 from Edema Disease of Pigs

LI Tianzhi,YU Xinyou
(Shandong Lvde Bio-Industry Co.,Ltd.,Binzhou 256600,China)

The pathogen was isolated on a dead pig from a Shandong Dongying farm.The serotype O8 Escherichia coli was confirmed by morphological observation,biochemical test,PCR assay,drug sensitive test and animal infection experimen.Results showed the isolates with multidrug-resistant,had certain pathogenic to Kunming mice and weaning pigs.

Escherichia coli;isolation;identification

S858.282.61+5

A

1002-1957(2016)04-0118-03

2016-06-25

山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目（SDAIT-06-022-15）；山東省自然科學基金項目（ZR2014CQ012）

李天芝（1985-），女，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷技術研究工作.E-mail:517493935@qq.com