杜洛克豬氟烷基因PCR-RFLP分析

楊雪梅，顧以韌，陶璇，梁艷，呂學斌

（四川省畜牧科學研究院，四川成都610066）

杜洛克豬氟烷基因PCR-RFLP分析

楊雪梅，顧以韌，陶璇，梁艷，呂學斌

（四川省畜牧科學研究院，四川成都610066）

應用PCR方法，體外擴增了47頭杜洛克豬的氟烷基因片段（659 bp），采用HhaⅠ內切酶對擴增產物進行了酶切多態性分析。結果表明，在試驗豬群中都呈現氟烷基因陽性，氟烷顯性基因頻率HalN頻率和隱性基因Haln頻率分別為1和0，該群體已實現氟烷隱性基因淘汰，可大面積供種。

杜洛克豬；氟烷基因；PCR-RFLP

豬應激綜合征（Porcine Stress Syndrome,PSS）是受豬染色體上隱性基因—氟烷基因控制，使得豬只受到外界環境的刺激時，臨床上出現發抖、呼吸急促困難、皮膚變紫、體溫升高、肌肉硬化甚至死亡等一系列癥狀，外界壓迫因素越大，對豬只造成的影響越強烈。氟烷基因的檢測方法先后有氟烷測定法、血液遺傳標記選擇法、CK血清水平測定法和DNA診斷法[1]。目前普遍應用的是聚合酶鏈反應結合限制性內切酶技術（polymerase chain reaction-restriction endonuclease fragment length polymorphism,PCR-RFLP），該技術快速、準確、便捷，且所需的樣品量極少，只需少量的全血、肌肉組織甚至幾根豬毛即可準確地檢測出豬的氟烷基因型[2-3]。本研究對杜洛克豬氟烷基因進行了PCR-RFLP分析，以判斷杜洛克豬的應激敏感性和尋找更多與肉質相關的遺傳信息，指導種豬的選育。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

試驗采用的杜洛克豬由四川省畜牧科學研究院科研實驗豬場提供，于2016年在四川省畜牧科學研究院科研實驗豬場進行試驗，共47頭。用耳號鉗取火柴頭大小的耳組織，每個個體采集耳組織樣1 g左右，放于裝有酒精的樣品管中，于-20℃冷凍保存。

1.2 試劑與儀器

主要試劑：基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；引物由華大基因公司合成，HhaⅠ限制性內切酶（NEB）購自成都飛奧生物科技有限公司。

主要儀器：Bio-rad MyCycler Thermal Cycler（Bio-Rad）、Sub-Cell GT電泳儀（Bio-Rad），凝膠成像系統（Bio-Rad）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA的提取按照DNA提取試劑盒進行，獲得的DNA樣品置-20℃保存備用。

1.3.2 引物設計引物合成參考文獻報道的序列設計[1]。上游引物：5'-TCCAGTTTGCCACAGGTCCTAC CA-3'；下游引物：5'-ATTCACCGGAGTGGAGTCTCT GAG-3'。

1.3.3 PCR反應PCR反應體系如下：1 μL PrimerⅠ（10 Umol/L），1 μL PrimerⅡ（10 Umol/L），10 μL 2× Taq Master Mix，DNA模板2 μL，加去離子水至總體積20 μL。PCR反應程序：94℃預變性4 min；然后4℃變性40 s，67℃復性40 s，72℃延伸50 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min。PCR產物置于4℃保存，各取5 μL PCR產物與分子質量2 000 bp Marker同時進行1%瓊脂糖電泳（130 V）25 min檢測，在凝膠成像系統中掃描成像。

1.3.4 擴增產物的HhaⅠ-RFLP分析按HhaⅠ內切酶說明書要求，取6 μL PCR產物，1 μL 10× BufferTango，0.5 μL HhaⅠ內切酶，加ddH2O至總體積10 μL。在37℃溫育酶切過夜，用1%瓊脂糖凝膠電泳（130 V）25 min分別對酶切產物進行檢測，成像系統觀察并記錄酶切結果。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

采用DNA試劑盒提取47頭杜洛克豬耳組織的基因組DNA，瓊脂糖電泳結果（圖1）表明，DNA的純度高，無RNA、蛋白質和多糖雜質，經Agilent Bioanalyzer 2100檢測OD值和DNA濃度均符合后續試驗的需求。

圖1 豬基因組DNA提取結果

2.2 氟烷基因PCR擴增

從豬耳組織樣品中提取基因組DNA，采用設計的引物PCR擴增后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測均顯示單一明亮條帶，其長度為659 bp的DNA片段（圖2）。

圖2 豬Hal基因PCR擴增電泳

2.3 氟烷基因酶切HhaⅠ-RFLP結果

HhaⅠ限制性內切酶可識別野生型HalN基因的5'-GCG↓C-3'即C位點，經PCR產物長度為659 bp，當氟烷基因未發生突變時，經HhaⅠ酶切后產生2個片段，長度分別為493 bp和166 bp，基因型為HalNN；當第1 843位堿基發生C→T突變時，不能被HhaⅠ識別，酶切后只有1個片段，長度為659 bp，基因型為Halnn；當一個氟烷等位基因發生突變，而另一個正常，經HhaⅠ酶切后產生3個片段，分別是659 bp、493 bp和166 bp，基因型為HalNn。本次檢測各樣品所獲659 bp的PCR產物，經HhaⅠ限制性內切酶酶切，均出現大小在493 bp和166 bp被完全切割的兩條條帶，無659 bp條帶殘留（圖3）。

圖3 豬Hal基因HhaⅠ-RFLP多態分型結果

2.4 豬Hal基因基因型頻率和基因頻率

由表1可見，所檢測種豬群中NN基因型為1.00，Nn和nn基因型均為0，N基因頻率為1.00，n基因頻率為0。被檢豬群氟烷基因型均為顯性純合子HalNN，未發現氟烷基因隱性純合子Halnn和氟烷基因雜合子HalNn，不含有氟烷敏感基因Haln。

表1 氟烷基因頻率和基因型頻率

3 討論

3.1 氟烷基因對肉質的影響

影響豬肉品質的因素主要包括遺傳因素、營養因素和環境因素，其中遺傳因素是影響豬肉性狀的重要因素之一。氟烷基因對肉質的影響具有雙效性：一方面氟烷基因攜帶者可以提高屠宰率和瘦肉率，眼肌面積也有所增加，這可能與氟烷基因攜帶者對應激敏感，肌肉收縮和代謝比正常個體強烈和持久，促進了肌肉的生長和脂肪的消耗有關；但另一方面，隱性氟烷基因豬在應激因子的作用下會誘發高熱綜合征，產生高頻率的PSE肉或DFD肉。大量研究結果均顯示，NN、Nn和nn型個體間，在肉色、pH和失水率等性狀上都存在顯著或極顯著的差異。這是因為當豬受到應激時，如果氟烷基因由顯性正?；蛲蛔優殡[性基因，就會造成鈣離子的非正常釋放，從而激活肌原纖維三磷酸腺苷酶和磷酸化酶，加強糖原酵解，造成肉色蒼白、肉質松軟、增加失水率并降低肉色和pH，從而降低豬肉的品質。本試驗檢測杜洛克豬群體中氟烷基因型均為NN型，表明該群體抗應激能力強，出現PSE或DFD肉的可能性小。

3.2 氟烷基因對豬繁殖性能的影響

在豬生產中，繁殖性能是一個重要的經濟性狀，產仔數的提升意味著養豬經濟效益的大幅上漲，但由于母豬產仔數遺傳力很低。想通過傳統的育種方法加以改良，難度很大，所以開發利用選育標記來提高豬的繁殖性能備受重視。張建軍等[4]報道豬氟烷基因Halnn比HalNN、HalNn雜合子每窩產仔數和產活仔數少2.0～2.7頭，繁殖性能NN>Nn>nn；鞠慧萍等[5]研究表明，氟烷敏感基因可導致總產仔數、產活仔數和斷奶仔豬數下降，初生窩重和個體斷奶重降低，并使生長速度減慢，即Haln對繁殖性能有較顯著的不良影響。因此，本試驗中該群體排除了氟烷基因對繁殖性能的影響。

本次試驗檢測的47頭杜洛克豬群中基因型均為NN，說明該豬育種場已實現氟烷敏感基因Haln的淘汰，可大面積推廣使用，為養豬生產和配套系育種提供良好的種豬。

[1]郭咪咪，梅書棋，喬木，等.巴克夏豬氟烷基因PCR-RFLP分析[J].湖北畜牧獸醫，2014，35（8）：5-7.

[2]叢玲，朱弘焱，蘇玉虹.遼寧種豬氟烷基因位點多態性分析[J].現代畜牧獸醫，2010（8）：73-75.

[3]劉銳.嘉興市鳳橋鎮豬氟烷基因檢測與對PSE肉的影響[J].江蘇農業科學，2011，39（2）：298-300.

[4]張建軍.氟烷基因對豬生產經濟性狀的影響[J].福建畜牧獸醫，2016，38（1）：17-19.

[5]鞠慧萍，伊萍，吳圣龍，等.氟烷基因對母豬繁殖性能的影響[J].揚州大學學報，2006，27（2）：80-82.

（編輯：富春妮）

關于咖啡你需要知道10件事

【美國趣味科學網站3月29日文章】題：關于咖啡你需要知道的10件事

神露還是毒藥？

咖啡是世界上流行范圍最廣的飲料之一，然而關于它的功效仍有爭議。長期以來科學家和美食家們對這種香噴噴的飲料有多種說法。它會要人命還是讓人更長壽？制作一杯完美的咖啡需要哪些要素？脫咖啡因咖啡真的沒咖啡因嗎？誰享用了第一杯咖啡？

1.咖啡因可能會要人命

盡管咖啡已知有許多好處，但它可能致命。不過健康專家說，這種情況十分罕見，除非你一口氣喝下80至100杯咖啡。但我們建議你不要輕易嘗試。2015年9月，美國食品和藥物管理局警告了粉狀咖啡因的危險，這種效力很強的產品近來突然成為熱銷貨。

2.咖啡可能有益健康

2014年、2015年和2016年的多項研究發現，咖啡有護肝作用，可能降低心臟病發作風險，還可能降低患結腸癌的幾率。據美國《循環》月刊報道，每天喝1到5杯咖啡可能降低早死的風險。2016年3月的一個研究發現，咖啡還與降低多發性硬化癥的風險有關聯。

3.咖啡因可能提高雌性性欲

至少在老鼠身上的試驗很有效。至于人類，研究人員說，咖啡可能可以提升那些不經常喝咖啡的人的性體驗。

4.咖啡因可以止疼

一個小研究發現，小劑量的咖啡因—大約兩杯咖啡的量—可以緩解體能鍛煉后的肌肉酸痛，但這個試驗的對象是不常喝咖啡的人。2012年的一個研究發現，在電腦前坐下工作之前喝杯咖啡，患肩頸疼的幾率會有所減少。然而這個試驗數據不太充分，無法對這種可能性下確切結論。

5.咖啡因真的可以在晚上提神

健康專家建議，睡前6個小時內不要喝咖啡，因為咖啡因的功效可以持續數小時。2015年的一個研究發現，咖啡因可以讓人體內生物鐘發生紊亂，干擾身體傳遞給你應該去睡覺的信號。另外一個研究顯示，上夜班的人可能發現，工作時喝的咖啡會影響白天的睡眠。

6.脫咖啡因咖啡其實有咖啡因

嘿!什么？！是的，沒錯：一個研究發現，如果你喝上5到10杯脫咖啡因咖啡，那么攝入的咖啡因與喝1至2杯常規咖啡相當。

7.脫咖啡因的工序需要用化學品

咖啡豆經過蒸煮，溶解后的咖啡因滲出表皮，然后通過一種叫二氯甲烷的有機溶劑洗去。

8.咖啡有苦味的罪魁不是咖啡因

咖啡苦味的主要來源不是咖啡因，而是咖啡中的抗氧化物。

9.好咖啡主要靠烘焙和泡制

要制作品質上佳的咖啡，工藝方面可以歸結為兩點：烘焙和泡制。在烘焙過程中，當溫度到達約400度時，咖啡豆開始出油。油分越多，味道越濃烈。煮咖啡時萃取時間越長，咖啡因的含量也越高，所以普通咖啡的咖啡因含量比意式濃咖啡或卡布奇諾高。

10.咖啡是山羊發現的

一千年前在非洲大陸的某座高山下，一群食用了紅色咖啡漿果的山羊讓一個牧羊人整夜沒睡。這位牧羊人把山羊的發現物送給一些祭司，結果大大延長了祭司們做禱告的時間。這個故事確實精彩。

小貼士一：一個研究顯示，美國人通過日常喝咖啡攝取大部分抗氧化物。每天喝1至2杯咖啡應該是有益的。或者如果你不喜歡咖啡，可以試試紅茶，消費量第二大的抗氧化物來源。此外香蕉、曬干的豆類和玉米也含有豐富的抗氧化物。

小貼士二：咖啡有通便作用，但科學家們也不知道為什么！

（轉自參考消息[N]，2016-04-01）

PCR-RFLP of Halothane Gene in Duroc

YANG Xuemei,GU Yiren,TAO Xuan,LIANG Yan,LV Xuebin
（Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China）

Using PCR method,the 47 Duroc pigs'halothane gene fragment(659 bp)had been amplified in vitro,which were carried through polymorphism analysis by HhaⅠendonuclease.The results showed that in experimental pigs the halothane gene was positive,dominant gene frequency HalN and recessive gene frequency were 1 and 0,the halothane recessive genes has been eliminated in group,large area for the species.

Duroc;halothane gene;PCR-RFLP

S828.8

A

1002-1957(2016)04-0082-03

2016-04-28

四川省科技計劃項目（2014NZ0092）；四川省基本科研業務費專項資金（SASA2013B02）；國家生豬產業技術體系-綜合試驗站（CARS-36）；四川省財政運行專項（SASA2014CZYX001）

楊雪梅（1981-），女，四川閬中人，助理研究員，碩士，研究方向為豬的遺傳育種.E-mail:544859309@qq.com

呂學斌（1965-），男，研究員，博士，研究方向為豬的遺傳育種.E-mail:lvxuebin@21cn.com