藏豬和杜洛克豬CAPN3基因表達差異及其與肉質性狀相關性分析

陶璇，顧以韌，梁艷，楊雪梅，鐘志君，陳曉暉，楊躍奎，曾凱，呂學斌

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都610066）

藏豬和杜洛克豬CAPN3基因表達差異及其與肉質性狀相關性分析

陶璇1，2，顧以韌1，2，梁艷1，2，楊雪梅1，2，鐘志君1，2，陳曉暉1，2，楊躍奎1，2，曾凱1，2，呂學斌1，2

（1.四川省畜牧科學研究院，四川成都610066；2.動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川成都610066）

為了揭示脂肪型的藏豬和瘦肉型的杜洛克豬肌肉生長及嫩度相關基因的表達差異，采用QRT-PCR方法檢測了兩豬種背最長肌中鈣蛋白酶3（CAPN3）基因在180日齡的表達差異，分析其表達與肌纖維面積（CSA）、肌肉剪切力的相關性。結果表明，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05）。相關性分析結果顯示，CAPN3 mRNA表達量與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負相關（P＜0.05）。以上結果初步揭示了兩豬種在180日齡CAPN3基因表達的品種差異，為深入研究豬肌肉生長及剪切力的調控機制提供了基礎數據。

豬；背最長??；熒光定量PCR；CAPN3基因；肌纖維面積；剪切力

鈣蛋白酶（Calpain,CAPN）是一種存在于細胞內的非溶酶體性的限制性蛋白水解酶，與肉的嫩度和風味等食用品質密切相關[1]，是理想的肉質嫩度分子標記[2]。Calpain3（CAPN3或P94）基因作為影響肉嫩度的候選基因，其分子生物學特性和生理調控功能是近年來研究的熱點之一。CAPN3是最典型的組織特異性鈣蛋白酶，只在骨骼肌中特異表達，且在骨骼肌細胞中其mRNA表達量是經典鈣蛋白酶的10倍，呈現高度表達[3]，與肌肉發育之間存在著密切關系[4]。目前關于CAPN3基因的研究，主要集中在CAPN3基因的克隆、多態性分析以及與雞、鴨、豬、牛及羊等物種肉質及胴體重相關性的探討上。Ilian等的研究揭示了CAPN3的mRNA水平[5]和蛋白質水平[6]與肉嫩度之間存在著強相關。侯冠彧等[7]對CAPN3基因的5'區域進行SNP檢測和基因型分析，初步斷定該基因本座位有影響肉牛生長及牛肉嫩度的傾向。Felicio等[8]進一步證實該基因多態性與雞腿肌重、烹飪損失及剪切力密切相關。鴨骨骼肌發育過程中，CAPN3基因與肌纖維類型和肌纖維的生長發育密切相關，其變異影響肉的品質[9]。對豬CAPN3的研究包括CAPN3基因的克隆及多態性檢測，但沒有與肉質性狀相關的報道[10-11]。本研究以選育程度低、瘦肉率低的藏豬和選育程度高、瘦肉率高的杜洛克豬為研究對象，采用熒光定量PCR（QRTPCR）方法研究兩豬種180日齡時背最長肌中CAPN3 mRNA的表達差異及其與肉質性狀的關系，為研究CAPN3基因影響肌肉生長及剪切力的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及采樣

試驗采用的藏豬、杜洛克豬均由四川省畜牧科學研究院科研實驗豬場提供。于2014年5月隨機挑選35日齡斷奶的藏豬、杜洛克豬各4頭，共計8頭組建群體，采用相同營養水平和飼喂方式，到180日齡時進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。采集倒數3～4肋骨間對應處的背最長肌樣品及最后肋骨向后8～10 cm完整背最長肌，一部分用于肌纖維面積、剪切力測定，另一部分浸泡于RNA later（Qiagen公司）中，隨后投入液氮中保存。

1.2 肉質性狀測定

1.2.1 肌纖維面積測定采用KD-2508型切片機（Kedee公司）按照冰凍切片標準制作流程制作背最長肌樣品的冰凍切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin&eosin,H&E）染色后用BK 5000型顯微成相系統（Optec公司）采集代表性區域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件計算每個樣品中100根肌纖維的面積。

1.2.2 剪切力測定屠宰后采集最后肋骨向后8～10 cm完整背最長肌，4℃冷藏熟化，48 h后取出裝入自封袋中，放入已設置水浴終止溫度為70℃的恒溫水浴鍋，待加熱至肉樣中心溫度為70℃時取出，剔除肌肉表面的膜、筋、腱和脂肪等，用肉樣取樣器取出肉樣（直徑1 cm），在CT3質構儀（Brookfield，美國）上測定樣品的剪切力，每個樣品做5個重復，取剪切力曲線相近3個測定值的平均值。

1.3 QRT-PCR測定CAPN3 mRNA相對表達量

1.3.1 總RNA提取和反轉錄肌肉樣品的總RNA提取按照mirVana Kit（Life Technologies Corporation, USA）試劑盒的操作說明書完成，并通過Agilent Bioanalyzer 2100對抽提的RNA進行質檢，然后使用SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit（TaKaRa公司）進行cDNA的合成。

1.3.2 PCR引物的設計與合成引物由Primer premier 5.0程序設計，深圳華大基因科技有限公司合成，信息見表1。

表1 熒光定量RT-PCR目的基因引物的相關信息

1.3.3 QRT-PCR在CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）儀器上進行mRNA熒光定量PCR檢測。PCR反應體系為25 μL：12.5 μL SYBR Green q-PCR Super Mix，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2 μL的cDNA模板，RNAase free水9.5 μL。采用兩步法進行熒光定量PCR的擴增。PCR循環參數為：95.0℃10 s；95.0℃5 s，60℃30 s，循環40次，PCR擴增后進行熔解曲線分析，溫度以0.5℃/30 s的速率從55.0℃緩慢遞增到95.0℃。試驗樣本和陰性對照每個樣本重復3次。

1.4 統計分析

選用肌肉組織中穩定表達的ACTB、TBP和TOP2B為看家基因，運用GeNorm軟件計算出看家基因的歸一化因子NF值（Normalization factor），以目的基因mRNA的拷貝數（最大拷貝數設為1）與對應樣品的NF值的比值表示基因mRNA的相對表達量[12]。采用SigmaPlot 12.5軟件對性狀指標和基因相對表達量進行t檢驗，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 肌纖維面積、剪切力測定

由表2可知，180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積分別為2 221.52 μm2、6 351.41 μm2，剪切力分別為3 581.25 g、6 548.25 g。藏豬肌纖維面積、剪切力均極顯著小于杜洛克豬（P＜0.01）。

表2 180日齡藏豬、杜洛克豬的肌纖維面積、剪切力

2.2 CAPN3 mRNA表達量及其與肌纖維面積、剪切力相關性分析

由圖1可知，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05）。對CAPN3 mRNA表達量與肉質性狀肌纖維面積、剪切力的相關性進行分析，結果見表3。由表3可知，CAPN3 mRNA表達量與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負相關（P＜0.05）。

圖1 180日齡藏豬與杜洛克豬CAPN3基因相對表達量

表3 CAPN3 mRNA表達量與肌纖維面積、剪切力相關性分析

3 討論

影響肉嫩度的因素有許多，包括肌纖維直徑、密度和類型，結締組織含量及組成，蛋白水解酶的含量及活性，肌糖原及肌內脂肪的含量，游離鈣離子濃度等。在這些因素中，Calpain的含量及活性是影響動物屠宰后肉嫩化的主要因素。在正常生理條件下，Calpain主要在細胞質中以無活性的狀態存在，動物屠宰后，肌細胞內儲存的鈣離子（Ca2+）從內質網小泡中釋放出來，使得細胞質中Ca2+濃度升高，Calpain被激活，從細胞質轉移至細胞膜或細胞器膜上，通過自溶降解肌聯蛋白和伴肌動蛋白，促進肉的嫩化[13]。

藏豬是國家級畜禽資源保護豬種，肌纖維細，肉質優良，而杜洛克豬肌纖維較粗，肉質較差。本研究結果顯示，同月齡藏豬肌纖維面積、肌肉剪切力均極顯著低于杜洛克豬（P＜0.01），這與藏豬和杜洛克豬的種質特性相一致。此外，180日齡藏豬CAPN3 mRNA表達量顯著高于杜洛克豬（P＜0.05），與肌纖維面積、剪切力均呈顯著負相關（P＜0.05），這與Showalter等[4]及Ilian等[5]研究結果一致，說明CAPN3基因會抑制肌纖維生長，同時在豬屠宰后促進肉的嫩化。

[1]Hopkins D L,Thompson J M.Inhibition of protease activity Part 1.The effect on tenderness and indicators of proteolysis in ovine muscle[J].Meat Science,2001,59:175-185.

[2]邱莫寒，鮮凌瑾，張平.鈣蛋白酶系統基因的研究進展[J].安徽農業科學，2009，37（28）：13628-13631.

[3]Nakajima T,Fukiage C,Azuma M,et al.Different expression patternsfor ubiquitous calpains and CAPN3 splice variants in monkeyocular tissues[J].Biochimica Et Biophysica Acta,2001, 15(19):55-64.

[4]Showalter C J,Engel A G.Acute quadriplegic myopathy:analysis of myosin isoforms and evidence for calpain-mediated proteolysis[J].Muscle Nerve,1997,20(3):316-322.

[5]Ilian M A,Morton J D,Kentm P,et al.Intermuscular variation in tenderness:Association with the ubiquitous and muscle specific calpain[J].Journal of Animal Science,2001,79(1):122-132.

[6]Ilian M A,Morton J D,Bekhit A E,et al.Effect of preslaughter feed withdrawal period on longissimus tenderness and the express of calpains in the ovine[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2001,49(4):1990-1998.

[7]侯冠彧，曾鴻普，王東勁，等.鈣蛋白酶3（CAPN3）基因多態性與牛胴體性狀的關聯分析[J].畜牧獸醫學報，2010，41（4）：398-402.

[8]Felicio A M,Boschiero C,Balieiro J C,et al.Identification and association of polymorphisms in CAPN1 and CAPN3 candidate genes related to performance an meat quality traits in chickens[J].Genetic and Molecular Research,2013,12(1):472-482.

[9]朱文奇，徐文娟，束婧婷，等.鴨骨骼肌早期發育過程中鈣蛋白酶3（CAPN3）基因的表達及其與肌纖維性狀的關聯[J].畜牧獸醫學報，2014，45（3）：385-390.

[10]邢明偉，孫麗華，劉娣.豬CAPN3基因的克隆及PCR-SSCP分析[J].黑龍江畜牧獸醫，2010（1）：29-30.

[11]楊秀芹.家豬、野豬CAPN家族4個基因的克隆、表達模式和多態性研究[D].哈爾濱：東北農業大學，2007.

[12]Erkens T,Poucke M V,Vandesompele J,et al.Development of a new set of reference genes for normalization of real-time RTPCR data of porcine backfat and longissimus dorsi muscle,and evaluation with PPARGC1A[J].Bmc Biotechnology,2006,6(1):41.

[13]Ilian M A,Bekhit A E D,Stevenson B,et al.Up and down regulationof longissimus tenderness parallels changes in the myofibril boundcalpain 3 protein[J].Meat Science,2004,67 (5):433-455.

（編輯：富春妮）

綠色環境有益女性長壽

據美國《環境健康展望》雜志刊登哈佛大學一項新研究發現，居住環境綠植多可顯著降低女性死亡率。與生活在綠植最少環境的女性相比，生活在綠植最多環境的女性死亡率可降低12%。

新研究中，哈佛大學陳曾熙公共衛生學院流行病學專家彼得·詹姆斯博士和布萊根婦女醫院專家對美國護士健康研究（2000—2008）涉及的108 630名女性的相關數據展開了梳理分析。研究人員對參試女性的死亡風險與其居住環境綠植水平進行了對比分析。新研究還考慮了年齡、社會經濟地位、種族及抽煙等其他死亡風險因素。結果發現，高綠植居住環境與低死亡率之間關聯性在呼吸道疾病和癌癥死亡率方面體現最明顯。與生活在低綠植居住環境的女性相比，生活在高綠植居住環境的女性呼吸道疾病死亡率降低34%，癌癥死亡率降低13%。

詹姆斯博士分析指出，最新研究結果與環保領域的一些建議是一致的。比如，綠色植物可減少空氣污染，降低噪音，改善環境，增加運動機會等等。這些都有益身體健康。

（轉自《中國中醫藥報》2016-04-28陳希/文）

Expression Differences of CAPN3 Gene and Its Correlation Analysis with Meat Quality Traits in Tibet and Duroc Pigs

TAO Xuan1，2,GU Yiren1，2,LIANG Yan1，2,YANG Xuemei1，2,ZHONG Zhijun1，2, CHEN Xiaohui1，2,YANG Yuekui1，2,ZENG Kai1，2,LV Xuebin1，2
(1.Sichuan Animal Science Academy,Chengdu 610066,China;2.Animal Breeding and Genetics Key Laboratory of Sichuan Province,Chengdu 610066,China)

To investigate the differential expression of Calpain3(CAPN3)gene between Tibet(a fatty, indigenous,Chinese breed)and Duroc(a leaner,Western breed)pigs.The expression differences of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle were measured in two pig breeds at the age of 180 days by using QRT-PCR approach,their correlations withcross sectional area of muscle fiber(CSA)and shear stress were also analyzed.The results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA in Tibet pigs was significantlyhigher than that of Duroc pigs at the age of 180 days(P＜0.05).The correlation analysis results showed that theexpression level of CAPN3 mRNA had significant negative correlation with CSA and shear stress(P＜0.05).These results suggested that the mRNA level of CAPN3 gene in longissimus dorsi muscle are different in Tibet and Duroc pigs at the age of 180 days,which provided some data for further study on elucidating the molecular mechanism of growth of muscle fibers and shear stress.

pig;longissimus dorsi muscle;QRT-PCR;CAPN3 gene;cross sectional area of muscle fiber;shear stress

S828.8

A

1002-1957(2016)04-0076-03

2016-06-22

國家生豬產業技術體系-綜合試驗站（CARS-36）；四川省科技支撐計劃（2014NZ0092）；國家現代農業產業技術體系四川創新團隊（sccxtd-001）；四川省財政運行專項（SASA2014 CZYX001）；四川省基本科研業務費專項資金（SASA2014A04）；四川省基本科研業務費專項資金（SASA2013B02）

陶璇（1982-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事豬遺傳育種與繁殖研究工作.E-mail:taoxuan0106＠163.com

呂學斌（1965-），男，研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究工作.E-mail:lvxuebin＠21cn.com