3種商品稀釋劑對關中黑豬精液常溫保存效果的研究

劉兆軍，謝景興，侯震坤，魏寧，楊公社，龐衛軍

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

3種商品稀釋劑對關中黑豬精液常溫保存效果的研究

劉兆軍，謝景興，侯震坤，魏寧，楊公社，龐衛軍

（西北農林科技大學動物科技學院，陜西楊凌712100）

研究通過檢測精子活率、質膜完整率、頂體完整率和線粒體膜完整率來評價3種商品稀釋劑對關中黑豬精液保存的效果。結果表明，日本某稀釋劑對關中黑豬精液常溫保存效果要顯著優于比利時以及英國某稀釋劑（P＜0.05），保存至第5天時日本某稀釋劑組的精子活率仍達到0.75，大于比利時某稀釋劑組的0.53和英國某稀釋劑組的0.51。此外，保存至第5天精子活率、頂體完整率、線粒體膜完整率保存效果上，比利時某稀釋劑組和英國某稀釋劑組較為相近，而在對質膜完整率的保存效果上，英國某稀釋劑組要顯著優于比利時某稀釋劑組（P＜0.05），保存至第5天時質膜完整率英國某稀釋劑組和比利時某稀釋劑組分別為44.52%和32.48%。

關中黑豬；豬精液；商品稀釋劑；常溫保存

關中黑豬是陜西省家畜育種專家培育的肉脂兼用型品種，具有抗病力強、繁殖力高、耐粗飼等特點。由巴克夏豬、甘肅涇川八眉豬、四川內江豬于20世紀70年代雜交繁育而成，并于20世紀80年代初完成鑒定獲得農業部首批地理標志產品品種。目前，關中黑豬養殖現狀處于保種狀態[1]。隨著人們消費觀念的改變，關中黑豬肉將可能成為人們青睞的商品豬肉。人工授精技術是關中黑豬產業化的必然選擇，豬精液稀釋劑是進行人工授精技術的關鍵之一，所以選擇適宜的精液稀釋劑對關中黑豬的人工授精技術推廣十分重要。目前，市場上銷售的商品稀釋粉種類繁多，且在地方品種或者培育品種精液常溫保存的研究報道不多。因此，選擇適宜關中黑豬精液的稀釋劑將有利于關中黑豬人工授精技術的推廣，并將促進關中黑豬產業化進程。

本試驗選取市售日本某稀釋劑、比利時某稀釋劑以及英國某稀釋劑，通過檢測精子活率、質膜完整性、頂體完整性、線粒體膜完整性等指標對比3種稀釋劑對關中黑豬精液的常溫保存效果，比較不同商品稀釋劑的優劣，為關中黑豬人工授精技術的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本試驗選取西北農林科技大學畜牧教學試驗基地的3頭10月齡關中黑豬種公豬作為精液來源動物。3頭公豬性成熟且發育良好，均按照相同的常規飼養方式進行單欄飼養。

1.2 主要試劑和儀器

pH試紙，市售日本某稀釋劑、比利時某稀釋劑以及英國某稀釋劑，雙蒸水，75%酒精，精子快速染液，Rh123（羅丹明123），PI（碘化丙啶），果糖-檸檬酸鈉低滲溶液。

Ibersan v11型精子密度儀、溫度計、普通光學顯微鏡、熒光顯微鏡，康佳BC-50MN 17℃恒溫冰箱、恒溫水浴鍋、37℃恒溫電熱板、移液槍、鑷子、滴管、玻璃棒等。

1.3 精液采集與處理

1.3.1 精液采集采用雙層手套手握法采精，用帶有4層過濾紗布和保溫杯收集富精子部分的精液。

1.3.2 檢測原精品質手握法采集種公豬濃精部分并用4層醫用紗布過濾后，在保溫杯中保存，立即到實驗室進行鏡檢，將精液用玻璃棒置于37℃恒溫載物臺上，觀察精子活力，稀釋后并計算其密度。選擇精子活率在0.70以上，色澤、氣味正常的精液用于后續試驗。

1.3.3 精液稀釋、分裝及保存精液稀釋前2 h，將3種稀釋劑置于37℃的水浴鍋中升溫備用，將檢測合格的精液分成3組，Ⅰ組采用日本某稀釋劑、Ⅱ組采用比利時某稀釋劑、Ⅲ組采用英國某稀釋劑，均按照1∶2的比例緩慢將等溫稀釋劑沿容器壁緩慢加入精液中，輕輕搖晃混勻。混勻后將稀釋后的豬精液分裝到提前預熱到37℃的50 mL離心管中，然后用4層毛巾包裹緩慢降溫，室溫放置2 h后連同毛巾一起放入17℃恒溫保存箱中保存，每隔12 h輕輕搖動精液1次。每隔24 h檢測精子各項指標，直至精子活力低于0.60。

1.4 檢測指標

1.4.1 精子活率采用10級制，在顯微鏡視野中估算直線前進運動精子所占全部精子的百分數。直線前進運動的精子為100%者評為1.0級，90%者為0.9級，以此類推。

1.4.2 精子質膜完整性分別從6個錐形瓶中用移液槍吸取精液0.1 mL加入裝有1 mL果糖-檸檬酸鈉低滲溶液的試管中混勻，37℃水浴30 min后取出，室溫靜置1 min，吸取滴片10 μL，用高倍鏡（400×）鏡檢，每次至少記錄200個精子中彎尾的精子數量，計算精子質膜完整率。

1.4.3 精子頂體完整性使用南京建成科技有限公司生產的精子快速染色液，試劑盒采用世界衛生組織（WHO）推薦的快速改良巴氏染色法，適用于精子形態檢查等。按照試劑盒說明書進行操作染色，最后在顯微鏡油鏡下觀察計數，并計算精子頂體完整性。

1.4.4 精子線粒體膜完整性使用Rh123和PI對精子進行聯合染色后，在熒光顯微鏡下觀察精子發光情況：1）精子頭部核區發出紅色熒光：死精子；2）精子發出綠色熒光：線粒體膜功能良好的精子；3）精子同時發出兩種熒光：處于將要死亡的過渡狀態的精子。精子線粒體膜完整率=線粒體膜完整精子數/計數精子總數×100%。

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1.5 統計分析

試驗所得數據經Excel 2013初步整理后，采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，結果以平均值±標準誤表示，用One-way ANOVA進行方差分析與顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 關中黑豬鮮精品質

經測定，關中黑豬精液品質的各項指標均符合國家標準，詳見表1。

表1 關中黑豬精液品質鑒定結果

2.2 不同稀釋劑對關中黑豬精子活率的影響

由表2可知，3種稀釋劑保存效果最好的是Ⅰ組，當保存時間達5 d時精子活率仍然維持在0.7以上，顯著好于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）。3種稀釋劑在第1天對精子保存的效果差異不明顯（P＞0.05），但從第2天開始，Ⅰ組保存效果要明顯優于Ⅱ組和Ⅲ組，而Ⅱ組和Ⅲ組的保存效果差異不顯著（P＞0.05）。

表2 3種稀釋劑對關中黑豬精子活率的影響

2.3 不同稀釋劑對關中黑豬精子質膜完整率的影響

由表3可知，在所選用的幾種稀釋劑中，對關中黑豬質膜完整性的保存效果最好的是Ⅰ組，其次為Ⅲ組，最差為Ⅱ組。在第1天和第2天時，Ⅱ組、Ⅲ組保存效果差異不顯著（P＞0.05），但從第3天開始，Ⅲ組保存效果要顯著優于Ⅱ組（P＜0.05）。

2.4 不同稀釋劑對關中黑豬精子頂體完整率的影響

由表4可知，Ⅰ組對關中黑豬精子頂體完整性的保存效果好于其他兩組。第1天和第2天時，Ⅰ組、Ⅱ組保存效果差異不明顯（P＞0.05）；從第3天開始，Ⅰ組保存效果要顯著優于Ⅱ組、Ⅲ組（P＜0.05），而Ⅱ組、Ⅲ組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 3種稀釋劑對關中黑豬精子質膜完整率的影響

表4 3種稀釋劑對關中黑豬精子頂體完整率的影響

2.5 不同稀釋劑對關中黑豬精子線粒體膜完整率的影響

由表5可知，Ⅰ組對關中黑豬精子線粒體膜完整性的保存效果顯著好于其他兩組（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅲ組差異不顯著（保存第3天精子線粒體膜完整率除外）。

表5 3種稀釋劑對關中黑豬精子線粒體膜完整率的影響

3 討論

目前，由于國外優良瘦肉型豬種對國內養豬業的巨大影響，我國許多地方品種和培育品種的養殖均受到不同程度的沖擊。由于養殖規模小，諸如梅山豬等地方品種和關中黑豬等培育品種基本處于保種和本交狀態。但隨著消費者態度的轉變，為促進關中黑豬等豬種的產業化進程，人工授精技術的普及不可或缺，對于該豬種常溫保存稀釋劑的選擇顯得尤為重要。陳曉暢等設計了5種稀釋劑配方對關中黑豬精液在17℃的保存效果試驗，篩選出最佳自配稀釋液[2]。本試驗選取市售的3種常見稀釋劑，對關中黑豬精液進行保存，根據保存效果判定篩選出最佳稀釋劑為日本某稀釋劑，這為后續關中黑豬的豬精液常溫保存和人工授精提供參考。邢軍等參考經典配方Androhep、choffow和葡-檸-EDTA并略作完善，應用于梅山豬精液17℃常溫保存，發現葡-檸-EDTA液保存的豬精子活率顯著低于前兩種稀釋液的保存效果[3]。此外，馬紅等、李玉芳等、邢軍等還分別對民豬、五指山豬、梅山豬和金華豬等地方豬種精液的冷凍保存技術進行了研究，對冷凍稀釋劑和保護劑進行了篩選[3-8]。我國地方豬種和培育品種繁多，對于這諸多品種豬精液的保存研究工作還有待進一步加強。

在人工授精過程中，精液的品質對于母豬的繁殖性能有著很大的影響。因此，在鮮精采集后需要對精液進行品質檢測[9]，保證在其輸入母豬子宮后能發揮其正常功能，減少母豬空懷，從而提高母豬的繁殖性能。同時，精液品質的好壞也能反映出種公豬的優良程度，并依據此調整公豬的飼糧、飼養管理方式，或直接淘汰。本試驗采得關中黑豬鮮精的平均密度和pH均大于陳曉暢等的試驗數據而采精量較小，其原因可能與豬只個體狀況和季節有關。精液性狀是關中黑豬種公豬繁殖性能的一項重要參考依據，在將來的工作中可以考慮通過大量的實踐確定關中黑豬精液性狀標準。

精液品質的鑒定主要包括采精量、顏色、pH、密度、活力、畸形率等指標，檢測方法可以概括為感官檢測和顯微鏡檢測[10]。但是，不論是感官檢測還是顯微鏡檢測，對于指標的判定，主要是以人為主觀來判定，極有可能會出現誤差，因此在精液品質鑒定過程中，應該增加樣本數以及取樣數，求其平均值，真實、客觀地反映出精液的品質。

目前，豬精液在常溫條件下保存仍是最為常用的方法，而在這一過程中，稀釋劑扮演著至關重要的角色。稀釋劑一方面需要為精子提供其體外生存的營養物質、緩沖物質、抗凍物質等，以維持其形態、結構特征，另一方面還需要滿足生產上的需要，使精液的使用率最大化。本試驗選取的3種市售稀釋劑，配方不同即其中所含的成分不同，對關中黑豬精液保存效果存在較大差異，其中日本某稀釋劑保存效果最佳，在保存第5天精子活率仍高于70%，而在其他兩種稀釋劑中保存的精子活率均低于60%，這可能與日本某稀釋劑中的抗氧化劑等特殊成分緊密相關。但不論何種品牌的稀釋劑，在對精液保存時，都必須保證精子的各項生理指標都合格。一般而言，稀釋劑的成分，成分濃度、配比都會影響到稀釋劑對精液的保存效果。以葡萄糖為例，不僅能為精子的存活供給三磷酸腺苷（ATP）以及營養物質，還能起到維持其滲透壓的作用，保持滲透壓的穩定性[11]，此外，它還能起到保護精子質膜完整性的作用。但有研究表明，如果稀釋劑中葡萄糖的濃度過高，則會對精子造成損傷[12]。pH和滲透壓的穩定有利于稀釋劑對精子的保存，所以，常常加入一些如碳酸氫鈉（NaHCO3）、檸檬酸鈉、Tris、HEPES等緩沖物質來調節稀釋劑的pH[13]，而滲透壓則可以通過添加葡萄糖之類的非離子物質維持其穩定。此外，在稀釋劑中添加適量的氯化鉀（KCl）能夠延長精子的保存時間，其原理在于一定濃度的鉀離子（K+）能維持精子膜上鈉鉀泵的運轉，在膜外K+濃度較低的條件下，能夠產生ATP維持精子的活動和生存。鈣離子（Ca2+）能啟動精子獲能，這對精子的保存是極其不利的，因此，常常在稀釋劑中加入能夠螯合Ca2+的EDTA，從而減少進入細胞內的Ca2+，以達到預期保存效果。精液在保存的過程中，常常會受到細菌、真菌等污染物的污染，使精子出現畸變甚至死亡[14]。為此，稀釋劑中會加入抗生素以避免污染物對于精子的侵害，但由于抗生素濫用現象普遍存在，使得很多細菌、真菌對于抗生素有著極大的耐藥性[15]，因此開發新的抗菌藥物勢在必行。

4 結論

日本某稀釋劑對關中黑豬精液常溫保存效果要明顯優于比利時某稀釋劑和英國某稀釋劑。此外，在對精子活率、頂體完整率和線粒體膜完整率保存效果上，比利時某稀釋劑和英國某稀釋劑較為接近；而在對質膜完整率的保存效果上，英國某稀釋劑要優于比利時某稀釋劑。

[1]王師澤.關中黑豬精液常溫保存研究[D].楊凌：西北農林科技大學，2014.

[2]陳曉暢，宋學太，王師哲，等.關中黑豬精液常溫保存研究[J].畜牧獸醫雜志，2015（2）：1-4.

[3]邢軍，王建才，楊劍波，等.不同稀釋劑對梅山豬精液冷凍保存效果的研究[J].畜牧與獸醫，2013（12）：24-28.

[4]馬紅，王文濤，劉娣.民豬精液冷凍技術研究[J].豬業科學，2013（7）：124-125.

[5]馬紅，王文濤，劉娣.海藻糖對民豬精液冷凍保存的影響[J].畜牧與獸醫，2014（11）：39-42.

[6]李玉芳，徐芹偉，張文昌，等.五指山豬精液冷凍保存研究[J].江西農業大學學報，2007（4）：612-615.

[7]王爭光，華堅青，陳曉峰，等.不同抗氧化劑對金華豬精液冷凍保存效果的影響[J].浙江大學學報（農業與生命科學版），2010（1）：104-108.

[8]任俊玲，馬恒東，李和平.不同抗氧化劑對豬精液冷凍保存效果的影響[J].中國畜牧雜志，2012（19）：37-41.

[9]宋學太.10 cm適度深部輸精對杜洛克、長白和大白母豬繁殖性能的影響[D].楊凌：西北農林科技大學，2015.

[10]王一明，張海蘭，謝鵬貴.豬精液品質檢測與處理[J].當代畜禽養殖業，2010（6）：14-16.

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[13]王龍.幾種不同稀釋液對公豬精液保存效果的影響[J].畜禽業，2011（3）：36-37.

[14]杜方均，宗衛陽.溫度和稀釋液對豬精液保存效果的影響[J].當代畜禽養殖業，2014（11）：5-6.

[15]Kuster C E,Althouse G C.The impact of bacteriospermia on boar sperm storage and reproductive performance[J].Theriogenology,2016,85(1)：21-26.

（編輯：富春妮）

The Effect of Guanzhong Black Pig's Semen Stored at Room Temperature in Three Commercial Extenders

LIU Zhaojun,XIE Jingxing,HOU Zhenkun,WEI Ning,YANG Gongshe,PANG Weijun
(CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestAgricultureandForestryUniversity,Yangling712100,China)

To evaluate the semen preservation effect of three kinds of commercial sperm extenders on Guanzhong black pig,we detected the sperm motility,membrane integrity,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity during sperm storage.Results showed that a certain kind of Japanese extender had the best preservation effect on Guanzhong black pig's sperm compared with the certain kind of Belgian extender and the certain kind of British extender(P＜0.05),the sperm motility of Japanese extender was 0.75,greater than 0.53 (Belgian extender group)and 0.51(British extender group)when save to 5 days.In addition,the preservation effect of Belgian extender and British extender on sperm motility,acrosome integrity and mitochondrial membrane integrity had no significant differences(P＞0.05).As for membrane integrity,the British extender group is better than the Belgian extender group(P＜0.05),Save to 5 days membrane integrity rates were 44.52%and 32.48%.

Guanzhong black pig;boar semen;commercial extenders;room temperature preservation

S828.3

A

1002-1957(2016)04-0033-04

2016-07-01

國家生豬產業技術體系（CARS-36）；西北農林科技大學試驗示范站（基地）科技成果推廣項目（TGZX2015-18）

劉兆軍（1993-），男，江西吉安人，在讀碩士研究生，研究方向為豬人工授精技術的研究工作.E-mail:liuzhaojun＠nwsuaf.edu.cn

龐衛軍（1972-），教授，博士生導師，研究方向為肌肉生物學與豬遺傳改良.E-mail：pwj1226＠nwafu.edu.cn