Peroxiredoxin-1基因沉默對轉化生長因子β1促進肺成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響*

劉寶欣， 劉英宇，魏中秋， 梁婷婷，范玉磊，楊 方，孫 影△

(1.華北理工大學附屬唐山市工人醫院呼吸內科，河北唐山 063000；2.華北理工大學基礎醫學院病理學系，河北唐山 063000)

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·技術與方法·

Peroxiredoxin-1基因沉默對轉化生長因子β1促進肺成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型膠原合成的影響*

劉寶欣1， 劉英宇1，魏中秋2， 梁婷婷2，范玉磊2，楊 方2，孫 影2△

(1.華北理工大學附屬唐山市工人醫院呼吸內科，河北唐山 063000；2.華北理工大學基礎醫學院病理學系，河北唐山 063000)

目的 探討Peroxiredoxin-1(Prx-1)基因沉默對轉化生長因子β1(TGF-β1)促進肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原的影響及其作用機制。方法 體外培養肺成纖維細胞分為4組：對照組(0.4%血清)，TGF-β1組(5μg/L)，TGF-β1+陰性轉染組(5μg/L TGF-β1+陰性對照siRNA)，TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組(5μg/L TGF-β1+Prx-1siRNA)。利用脂質體Lipo2000將陰性對照siRNA和Prx-1siRNA分別轉染到TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1+ Prx-1siRNA轉染組的肺成纖維細胞中，轉染48h后用于后續實驗。實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測轉染后各組的Prx-1mRNA表達水平，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測磷酸化Akt(p-Akt)及Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白水平，2,7-二氯熒光素二乙酸檢測活性氧(ROS)水平。結果 (1) Prx-1siRNA轉染肺成纖維細胞后，TGF-β1+ Prx-1siRNA轉染組的Prx-1mRNA表達明顯降低。(2) 與對照組比較，TGF-β1組Ⅰ和Ⅲ 型膠原、ROS及p-Akt蛋白水平均明顯增加(0.34±0.06vs. 0.58±0.06、0.42±0.05vs. 0.56±0.06、2988±379vs. 4315±580和0.29±0.05vs. 0.66±0.07，差異有統計學意義(P<0.05)。與TGF-β1組比較，TGF-β1+陰性轉染組Ⅰ和Ⅲ型膠原、ROS及p-Akt水平無明顯變化(P>0.05)，但TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組Ⅰ和Ⅲ 型膠原、ROS及p-Akt蛋白水平均進一步增高(0.58±0.06vs. 0.79±0.09、0.56±0.06vs. 0.77±0.08、4315±580vs. 5841±782和0.66±0.07vs. 0.93±0.15，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 TGF-β1能夠誘導肺成纖維細胞生成ROS，并由此促進Akt的激活和肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原；而沉默Prx-1基因可激活ROS/Akt通路，從而有助于TGF-β1促進肺成纖維細胞合成膠原。

活性氧；轉化生長因子-β1；膠原；Peroxiredoxin-1

矽肺是長期吸入二氧化硅粉塵而引起的一種職業病，其主要病理變化是肺組織彌漫性纖維化，Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達增多是其中重要原因之一[1]。轉化生長因子β1(transforming growth factro-β1，TGF-β1)在矽肺肺組織中表達增高，具有促纖維化作用。筆者前期研究顯示，TGF-β1可通過上調活性氧(reactive oxygen specie，ROS)激活C-Jun蛋白激酶(JNK)細胞內信號傳導通路，從而促進肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原[2-3]。最近Lu等[4]報道博來霉素通過激活ROS/Akt通路促進肺組織纖維化。Peroxiredoxin 家族是一類新發現的過氧化物酶，其中，Peroxiredoxin 1(Prx-1)在哺乳動物中廣泛表達，可快速有效地清除細胞內產生的ROS，并抑制ROS介導的細胞內傳導通路激活[5]。但在矽肺纖維化過程中，目前并不清楚ROS/Akt通路是否介導了TGF-β1促肺成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ 型膠原合成增加的作用，及Prx-1是否通過抑制ROS/Akt通路激活來抑制TGF-β1的促纖維化作用。本項目利用TGF-β1刺激正常及轉染Prx-1siRNA的肺成纖維細胞，檢測Ⅰ和Ⅲ型膠原、ROS及Akt磷酸化的變化，探討Prx-1對ROS/Akt通路介導的TGF-β1促纖維化作用的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胚胎肺成纖維細胞MRC-5購自中國科學院細胞庫；TGF-β1購自美國Peprotech公司；總Akt(T-Akt)及磷酸化Akt(p-Akt)抗體購自美國Cell Signaling公司；Prx-1抗體購自美國Abcam產品公司；Ⅰ、Ⅲ型膠原抗體和GAPDH抗體購自武漢博士德生物有限公司；Prx-1siRNA及Prx-1基因上、下游引物由上海吉瑪公司合成；M-MLV逆轉錄試劑盒、SYBR+Tap混合劑購自美國Invitrogen公司；活性氧檢測試劑盒購自江蘇南通碧云天生物技術公司。凝膠圖像分析儀購自美國Bio-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 肺成纖維細胞的培養 肺成纖維細胞在5%血清水平的改良杜氏伊格爾培養基(DMEM)，5% CO2，37℃條件下常規體外培養。

1.2.2 實驗分組 MRC-5細胞分為4組：對照組(0.4%血清)，TGF-β1組(5μg/L)，TGF-β1+陰性轉染組(5μg/L TGF-β1+陰性對照siRNA)，TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組(5μg/L TGF-β1+Prx-1siRNA)，每組樣本數為5。本研究共設計3個不同靶基因位點的特異性Prx-1siRNA，分別是Prx-1siRNA-209、Prx-1siRNA-289、Prx-1siRNA-453，選擇抑制作用最明顯的Prx-1siRNA用于實驗。利用脂質體Lipo2000將陰性對照siRNA、Prx-1siRNA分別轉染到TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組，轉染48h后各組細胞用0.4%血清培養12h，使其同步化。

1.2.3 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測Prx-1siRNA轉染后Prx-1mRNA水平 Trizol法提取對照組、TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組的細胞總RNA。逆轉錄后取行RT-PCR，擴增體系如下：SYRB+Taq混合劑10μL，Prx-1或甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)上、下游引物各0.5μL(Prx-1的上游引物為5′-CCC CAC GGA GAT CAT TGC TT-3′，Prx-1的下游引物為5′-CGA GAT GCC TTC ATC AGC CT-3′；GAPDH的上游引物為5′-ATG AAT GGG CAG CCG TTA GG-3′，GAPDH的下游引物為5′-TGG ATT TGC CAT GGG TGG A-3′，cDNA 1μL，雙蒸水8μL；循環參數為：95℃預變性30s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s，循環40次。

1.2.4 2,7-二氯熒光素二乙酸檢測細胞內ROS水平 2,7-二氯熒光素二乙酸(無熒光)進入細胞后被酯酶分解，生成還原型二氯熒光素(無熒光)，還原型二氯熒光素不但無法穿過細胞膜，還可被細胞內的ROS氧化生成氧化型二氯熒光素，二氯熒光素可發出熒光，因此熒光量可間接反映細胞內ROS水平。本研究中，細胞同步化后，與TGF-β1共孵育20min，收集制備單細胞懸液。加入2,7-二氯熒光素二乙酸(終濃度為10μmol/L)，37℃孵育20min，洗滌后計數1×104個細胞，熒光酶標儀(激發波長488nm，發射波長525nm)檢測各組的熒光強度。

1.2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Ⅰ、Ⅲ型膠原和Akt水平 各組細胞同步化后，與TGF-β1共孵育45min (用于檢測p-Akt)和48h(用于檢測Ⅰ和Ⅲ型膠原蛋白)，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后細胞裂解液裂解細胞30min，收集細胞，離心后收集上清液，-70℃保存。利用考馬斯亮藍法測定細胞總蛋白濃度，并以每孔20μg總蛋白量進行電泳。轉膜后，經5%牛血清清蛋白室溫孵育1h，T-Akt、p-Akt、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和GAPDH抗體(均1∶1000稀釋) 4℃孵育過夜，Ⅱ抗(均1∶3000稀釋)室溫孵育2h，BCIP/NBT(1∶50稀釋)顯色3min。Image J軟件掃描蛋白表達條帶并進行定量分析。p-Akt與T-Akt的比值為p-Akt的表達值，Ⅰ或Ⅲ型膠原與GAPDH的比值為Ⅰ或Ⅲ型膠原的表達值。

2 結 果

2.1 Prx-1siRNA轉染對肺成纖維細胞Prx-1mRNA表達的影響 RT-PCR結果顯示，對照組和TGF-β1+陰性轉染組的Prx-1mRNA的表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。與對照組和TGF-β1+陰性轉染組相比，轉染的3個特異性Prx-1siRNA均可不同程度地降低肺成纖維細胞Prx-1mRNA水平，其中，以Prx-1siRNA-453抑制作用最明顯，遂將Prx-1siRNA-453用于后續實驗，見表1。

表1 Prx-1siRNA轉染對MRC-5細胞Prx-1mRNA表達的影響

2.2 Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達 Western blot結果顯示，對照組Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達值分別為0.34±0.06和0.42±0.05，TGF-β1組Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達值分別為0.59±0.07和0.57±0.07，TGF-β1組Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。TGF-β1+陰性轉染組Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達值分別為0.52±0.07和0.58±0.09，與TGF-β1組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。但TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組Ⅰ和Ⅲ型膠原的表達值分別為0.79±0.09和0.77±0.08，明顯高于TGF-β1組的表達，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

1:對照組；2:TGF-β1組；3:TGF-β1+陰性轉染組；4:TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組。

2.3 ROS水平 對照組、TGF-β1組、TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組的熒光強度分別為2988±379、4315±580、4850±572、5841±782。TGF-β1組的熒光強度顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1組的熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)，但TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組的熒光強度明顯高于TGF-β1組，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 T-Akt及p-Akt的表達 各組T-Akt水平差異無統計學意義(P>0.05)。對照組、TGF-β1組、TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組的p-Akt表達值分別為0.29±0.05、0.65±0.07、0.70±0.10和0.93±0.15。TGF-β1組p-Akt表達明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.01)。TGF-β1+陰性轉染組和TGF-β1組p-Akt表達差異無統計學意義(P>0.05)，但TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組p-Akt表達明顯高于TGF-β1組，差異有統計學意義(P<0.01，圖2)。

1:對照組；2:TGF-β1組；3:TGF-β1+陰性轉染組；4:TGF-β1+Prx-1siRNA轉染組。

3 討 論

ROS是在人體有氧代謝過程中產生的一類含有活性氧功能基團的化合物，包括氧自由基、過氧化物和激發態氧等。正常時ROS的生成與清除保持動態平衡，濃度很低，參與機體免疫過程、抵抗損傷等，對機體有保護作用。但病理狀態下ROS生成增多或清除減少，濃度增高，通過攻擊細胞脂質、蛋白質和DNA引起細胞損傷[6]。另外，ROS還參與細胞內信號轉導通路，作為TGF-β1等多種細胞因子的第二信使，調節ERK1/2、JNK等信號轉導途徑，介導細胞增殖和膠原合成等[2,7]。Akt又稱蛋白激酶B，其激酶活性區的氨基酸組成與蛋白激酶A和蛋白激酶C具有高度的同源性。Akt屬于一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，當其第308位蘇氨酸和第473位絲氨酸發生磷酸化時，該激酶即被激活，并從細胞膜轉移到細胞內，通過調控下游靶蛋白，進而調節細胞生物學活動。最近研究顯示，ROS激活的Akt途徑在膠原的合成過程中發揮重要作用。如Liu等[8]報道在卵清蛋白誘導的哮喘和氣道重塑過程中，高良姜素通過抑制ROS/Akt途徑抑制膠原蛋白的合成，說明ROS/Akt通路介導了卵清蛋白誘導的膠原合成增加。Pérez de Obanos等[9]也報道谷胱甘肽通過降低ROS水平抑制了亮氨酸激活的Akt途徑，從而減少肝星形細胞合成Ⅰ型膠原。

利用Western blot，本研究發現TGF-β1刺激肺成纖維細胞48h后，Ⅰ和Ⅲ型膠原表達水平較對照組分別增高了1.71和1.33倍，說明TGF-β1可誘導肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原；同時TGF-β1組的ROS及p-Akt水平也明顯增高，提示ROS/Akt信號通路的激活在TGF-β1誘導的肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原過程中發揮著重要作用。

Prx-1是一種新型過氧化物酶，具有強大的抗氧化能力，其含有的過氧化半胱氨酸和可溶性半胱氨酸是消除H2O2的主要功能基團。首先過氧化半胱氨酸與H2O2作用，失去質子，轉變為半胱氨酸次磺酸。然后半胱氨酸次磺酸再通過二硫鍵與可溶性半胱氨酸縮合，并在細胞內的二硫鍵還原酶作用下還原為氧化半胱氨酸，回到初始狀態。這個循環過程可有效降低H2O2水平[10]。現已發現在多種疾病中Prx-1均可通過降低ROS來調節細胞的生物學活性，如Prx-1通過降低ROS抑制內皮細胞線粒體的損傷及線粒體介導的細胞凋亡[11]。Madrigal-Matute等[12]最新研究發現Prx-1與NADPH氧化酶在人動脈粥樣硬化斑塊巨噬細胞中表達位置相同，表達水平也呈正相關，認為不但Prx-1可在ROS產生的第一時間原位將其清除，而且對ROS敏感度高，是氧化應激的“感受器”。另外，更重要的是Prx-1還可抑制ROS介導的細胞內信號傳導通路激活，如在β-拉帕醌(一種抗癌藥)誘導的人子宮頸癌細胞凋亡過程中，凋亡信號調節激酶(ASK1)可通過激活JNK途徑促進細胞凋亡，而Prx-1可通過促進TRX與ASK1的結合而抑制ASK1的活性和細胞凋亡[13]。

利用體內外實驗，筆者前期研究發現Prx-1在矽肺大鼠肺組織中表達增高， Prx-1可以通過抑制ROS來抑制JNK和ERK1/2通路激活，抑制TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖及膠原合成增加，從而抑制矽肺纖維化[3,7,14]。本實驗利用Prx-1siRNA轉染肺成纖維細胞使肺成纖維細胞Prx-1基因沉默，發現沉默Prx-1基因后可明顯上調TGF-β1刺激的ROS水平，同時p-Akt 和Ⅰ、Ⅲ型膠原合成增強，說明沉默Prx-1基因可激活ROS/Akt信號傳導通路，從而有助于TGF-β1促進肺成纖維細胞合成膠原。也進一步證實TGF-β1誘導的肺成纖維細胞合成Ⅰ和Ⅲ型膠原過程中，ROS/Akt信號傳導通路的激活具有重要的促進作用。

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Effect of silencing peroxiredoxin-1on the expressions of collagen type Ⅰ and Ⅲ in TGF-β1induced pulmonary fibroblasts*

Liu Baoxin1,Liu Yingyu1,Wei Zhongqiu2,Liang Tingting2,Fan Yulei2,Yang Fang2,Sun Ying2△

(1.Department of Respiratory Medicine,Tangshan Works Hospital Affiliated to North China University ofScience and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China;2.Department of Pathology,Primary MedicineCollege,North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China)

Objective To investigate the effect of silencing peroxiredoxin-1(Prx-1) on the expressions of collagen type Ⅰ and Ⅲ in TGF-β1-induced pulmonary fibroblasts and the possible mechanism.Methods Cultured pulmonary fibroblasts were randomly divided into four groups:control group(0.4% serum),TGF-β1group(5μg/L),TGF-β1+negative transfection group(TGF-β1+scramble siRNA) and TGF-β1+Prx-1siRNA transfection group(TGF-β1+Prx-1siRNA).The negative control siRNA and siRNA Prx-1were transfected into the lung fibroblast cells transfected with TGF-β1+negative transfection group and TGF-β1+Prx-1siRNA transfection group by liposome Lipo2000respectively.After 48h,the cells were was used for subsequent experiments.Real-time PCR was used to evaluate Prx-1mRNA.Western blot was employed to detect the expressions of collagen type Ⅰ and Ⅲ,phosphorylated Akt(p-Akt),and total Akt.Reactive oxygen species (ROS) were measured by DCFH-DA.Results (1)After transfection of siRNA Prx-1into the lung fibroblasts,Prx-1mRNA expression was significantly decreased in the TGF-β1+ Prx-1siRNA group.(2) Compared with control group,expressions of collagen type Ⅰ and Ⅲ,ROS and p-Akt in TGF-β1group were all increased 0.34±0.06vs. 0.58±0.06,0.42±0.05vs. 0.56±0.06,2988±379vs. 4315±580,0.29±0.05vs. 0.66±0.07,(P<0.01).There were no differences in the levels of collagen,ROS and p-Akt between TGF-β1group and TGF-β1+negative transfection group(P>0.05).However，the levels of collagen type Ⅰ and Ⅲ,ROS and p-Akt in TGF-β1+Prx-1siRNA transfection group were further higher than TGF-β1group 0.58±0.06vs. 0.79±0.09,0.56±0.06vs. 0.77±0.08,4315±580vs. 5841±782and 0.66±0.07vs. 0.93±0.15,(P<0.05).Conclusion TGF-β1induces pulmonary fibroblasts to generate ROS,which contributes to Akt activation and collagen type Ⅰ and Ⅲ synthesis;these changes become more obvious with the treatment of Prx-1siRNA.

reactive oxygen species；transforming growth factro-β1；collagen;Peroxiredoxin-1

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.022

國家自然科學基金資助項目(81072254)；唐山市科學技術研究與發展基金資助項目(14130275B)。作者簡介：劉寶欣(1974-)，副主任醫師，本科，主要從事肺癌研究。△

R563.9

A

1671-8348(2016)29-4099-04

2016-03-02

2016-04-19)