MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究進展*

王美姣 綜述,于廷和 審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科重點實驗室 400010)

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MARCH家族蛋白在免疫、生殖等方面的研究進展*

王美姣 綜述,于廷和△審校

(重慶醫科大學附屬第二醫院婦產科重點實驗室 400010)

MARCH；E3泛素連接酶；免疫調節；精子

膜相關RING-CH(membrane-associated RING-CH,MARCH)家族是近年發現的一類屬于E3泛素連接酶的環指結構域家族，迄今已發現的MARCH家族成員有11種，分別是MARCH1～11。MARCH家族的成員分布廣泛，參與多種細胞功能，如免疫調節，蛋白質量控制和膜轉運，內質網相關降解，內體蛋白質運輸，線粒體動力學平衡和精子發生調控等[1-9]。MARCH家族蛋白相關領域的研究正日益受到重視，因此，本文從MARCH家族蛋白的分類、生物學結構、表達及在免疫、生殖等生物學功能方面就MARCH家族最新研究進展作一綜述，旨在為下一步的功能研究和臨床研究提供依據。

1 MARCH家族成員的生物學結構

MARCH家族蛋白結構相對保守，大多數MARCH家族蛋白具有類似結構：一個N端的環指結構域，又稱RING結構域和零個、兩個或多個C端的跨膜結構域(圖1)。RING結構域是此家族具有E3泛素連接酶作用的重要因素。E3泛素連接酶的活性依賴于環指結構域，并通過其與E2泛素結合酶相連。這個環指結構域具有特殊的C3HC4結構，由1個3條鏈組成的β折疊片層、1個α螺旋和兩個大環構成。每一環指結構域連有兩個鋅離子，RING結構域通過與這兩個鋅離子螯合穩定其結構。MARCH家族的11個成員中有9個成員(MARCH1、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH5、MARCH6、MARCH8、MARCH9和MARCH11)含有疏水跨膜結構域，并定位于質膜和細胞器膜。典型的MARCH蛋白特征是2個跨膜域，但MARCH5有4個跨膜域，MARCH6甚至有14個跨膜域，而MARCH7和MARCH10結構特征類似，均不含有跨膜域，其序列同源性僅存在于環指結構域[3,8,10]。MARCH1和MARCH8、MARCH2和MARCH3，以及MARCH4和MARCH9之間高度序列同源，表明這些兩兩高度同源蛋白具有部分相似功能[1]。

圖1 MARCH結構示意圖

2 MARCH家族各成員的表達與生物學功能

MARCH家族各成員各具特點和功能，其若干成員還能協同參與多種生理病理功能，見表1。

表1 MARCH各成員概要

2.1 MARCH1、MARCH2、MARCH3、MARCH4、MARCH9和MARCH8及其與免疫功能

2.1.1 MARCH1 MARCH1，又稱RNF171，含約289個氨基酸，相對分子質量約為3.2×104，是一種與主要組織相容性復合體(MHC)-Ⅱ類分子相關的E3泛素連接酶，主要表達在次級淋巴組織、淋巴結和脾臟的濾泡B細胞上，并高表達于抗原提呈細胞、B細胞和樹突細胞(dendritic cells,DCs)，在免疫系統中具有重要的調節作用[11]。MARCH1能泛素化轉鐵蛋白受體TFRC、CD86(B7-2)、FAS和MHC-Ⅱ類蛋白(如HLA-DRα和β)，并通過多泡體(multivesicular body,MVB)分選到溶酶體，促使其降解[12]。Ohmura-Hoshino等[11]研究表明，在多器官障礙綜合征(MODS)病程中，MARCH1可能通過泛素化MHC-Ⅱ類分子來調控其表達水平，進而調控DCs的成熟狀態及啟動免疫應答反應，從而起著關鍵性作用，MARCH1可作為一個治療靶點，以降低MODS臨床病死率。MODS病程中MARCH1通過泛素化MHC-Ⅱ類分子來調控其表達并進一步調控DCs抗原提呈作用的具體機制尚需進一步深入研究。Toll作用蛋白(Tollip)會導致MARCH1表達下降而恢復MHC-Ⅱ類分子水平，因此，MARCH1可能是一種新的Tollip靶點。

盡管MARCH1表達僅限于次級淋巴器官[1]，但它能被不同刺激物所誘導或抑制。如白細胞介素10(IL-10)在人初級單核細胞和小鼠B細胞中可調節其表達。MARCH1可作為IL-10誘導的對MHC-Ⅱ抗原呈遞途徑的免疫抑制效應的調控者。通過反向IL-10誘導MARCH1介導的泛素化和降解，CD83能增加樹突狀細胞MHC-Ⅱ和CD86(B7-2)。LPS誘導的DCs成熟可抑制MARCH1表達，允許新合成的MHC-Ⅱ類分子在細胞表面表達[12]。

2.1.2 MARCH2和MARCH3 在MARCH家族中，MARCH2和MARCH3是相關度最高的蛋白，有63%的蛋白序列相同[5]，是兩個高爾基定位的E3泛素連接酶。MARCH2，含約246個氨基酸，相對分子質量約為2.7×104，廣泛表達于各種組織，定位于內質網膜、溶酶體膜和內涵體膜。MARCH2可介導TFRC和CD86(B7.2)的泛素化，并促進其隨后的內吞作用和通過MVB分選到溶酶體，從而調節細胞表面β腎上腺素受體的表達[13]。MARCH2能與DLG1相互作用。MARCH2是一種參與胞內轉運的突觸6結合蛋白[4]。Cheng等[14]報道，MARCH2通過其聯合適配蛋白CAL和syntaxin 6(STX6)泛素化并降解CFTR。 MARCH3，含約253個氨基酸，相對分子質量約為2.9×104，定位于早期內涵體膜和多通道膜，可能參與了內涵體運輸通路[5]。Koebis等[15]的研究顯示，MARCH3在虹鱒魚低表達，可能參與免疫系統、囊泡運輸和蛋白泛素化。

2.1.3 MARCH4和MARCH9 MARCH4，含約410個氨基酸，相對分子質量約為4.6×104，定位于高爾基體膜和多通道膜，可能介導MHC-Ⅰ和CD4的泛素化，并促進其后續內吞作用和通過MVB分選到溶酶體，從而參與免疫系統的調節[1]。MARCH9，又稱RNF179，含約346個氨基酸，相對分子質量約為3.8×104，廣泛表達于人組織，定位于高爾基體膜、多通道膜和溶酶體膜，可能介導MHC-Ⅰ、CD4和關鍵細黏附分子ICAM-1的泛素化，并促進其隨后的內吞作用和通過MVB分選到溶酶體，從而參與免疫系統的調節[16]。過表達MARCH9導致細胞表面MHC-Ⅰ、CD4和ICAM-1下調。此外，MARCH9僅特異性與HLA-DQ相互作用[17]。

2.1.4 MARCH8 MARCH8，也稱C-MIR，含約291個氨基酸，相對分子質量約為3.3×104，廣泛表達于各種組織，高表達于肺和胰腺，存在于未成熟樹突狀細胞，定位于細胞質泡膜、溶酶體膜和早期內涵體膜，能介導CD86(B7-2)、TFRC、FAS和MHC-Ⅱ類蛋白質，如HLA-DP、-DQ和-DR的泛素化，并促進其隨后的內吞作用和通過MVB分選到溶酶體。對乳腺癌細胞的研究發現，MARCH8能調控腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體(TRAIL)受體的穩態細胞表面表達，是一種腫瘤細胞對TRAIL受體的潛在治療靶點[18]。MARCH8泛素化降解IL-1受體輔助蛋白(IL1ARP)抑制IL-1β對NF-κB和MAPK的激活，即MARCH8為IL-1β誘導的NF-κB激活途徑的特異性抑制劑，為解析天然免疫信號轉導的調控機制提供了更多的研究證據，同時也為將來的藥物設計提供可能的靶標。Kim等[19]研究發現，MARCH8在斑馬魚卵、斑馬魚和非洲爪蟾的早期胚胎表達，表明其可能在胚胎發育中發揮作用。MARCH8過表達和敲除均導致畸形發育。E-cadherin能被MARCH8泛素化，過表達MARCH8導致E-cadherin降低，表明MARCH8能通過調節E-cadherin的定位來調節細胞黏附強度而對胚胎起作用。因此，適當的MARCH8水平對胚胎生存和細胞黏附維持至關重要。

2.2 MARCH7、MARCH10和MARCH11及其與雄性生殖的關系。

2.2.1 MARCH7 MARCH7，又稱Axotrophin，含約690個氨基酸，相對分子質量約為7.8×104，是一種帶有單一RING結構域的蛋白質，其重要相似基因是MARCH10。MARCH7的RING結構域與C末端靠近，其N末端為富含絲氨酸/脯氨酸的高度無序結構[10]。MARCH7在脊椎動物中高度保守，尤其在哺乳動物。人類和鼠約85%的氨基酸序列同源，且有一個相同的RING-CH結構域，基因表達譜也相似。最近有研究者對MARCH7在人細胞和組織的表達譜進行篩選，發現MARCH7可在不同類型的人細胞和組織中表達：在人上皮細胞高表達，海馬和小腦的神經元和神經元祖細胞、脾血竇內皮細胞、骨髓巨核細胞、小腸隱窩肝細胞和肺泡巨噬細胞中選擇性表達，也能在睪丸早期生精細胞、附睪腺上皮表達。Zhao等[7]研究證實，MARCH7在大鼠精子細胞發育的中后期高表達，定位于頂體和鞭毛，可能參與精子頭部和鞭毛的形成。Lys48多泛素化鏈存在于大鼠精子細胞的頂體/acroplaxome、頸部、尾部中段和胞漿，MARCH7介導Lys48多泛素化鏈進入蛋白酶體被降解。

此外，MARCH7也與神經退行性疾病和免疫耐受相關。MARCH7為正常大腦發育所必需，March7敲除小鼠能存活并具有生育能力，但顯示過早神經退行性變和胼胝體的發育缺陷。MARCH7的功能與Foxp3和白血病抑制因子(LIF)相關，在T細胞的增殖、免疫耐受和神經細胞的發育中具有重要作用。Gao等[20]使用MARCH7缺失小鼠，發現其對T淋巴細胞應答具有極大影響，包括了干細胞的細胞因子LIF 8倍過度增殖和5倍過量釋放。他們進一步發現：MARCH7是LIF受體亞單位gp190靶向降解所必須的，這就意味著MARCH7在LIF信號調節中起直接作用。Nathan等[10]研究發現，MARCH7趨向于自身泛素化，并與兩個去泛素化酶相關-去泛素化酶ubiquitin-specific protease(USP)9X(定位在胞質)和USP7(定位在胞核)。Flach等[21]表明，MARCH7與Tau蛋白相互作用，當體外微管結合受損時，在微管結合區域能單泛素化Tau。

2.2.2 MARCH10 MARCH10，含約808個氨基酸，相對分子質量約為9.0×104，其重要相似基因是MARCH7。Iyengar等[8]研究發現MARCH10定位于大鼠長形精子細胞的主段，是一種精子形成期調控精子細胞鞭毛形成和穩定微管的泛素連接酶。March10基因產物的兩種同種型March10a和March10b主要在睪丸表達。MARCH10a與MARCH10b的功能不同：March10a編碼一種具有泛素連接酶活性的長環指蛋白，是一種微管相關蛋白，在微管結構中發揮作用；而March10b定位于胞質，編碼一種缺少環指結構域的短富含脯氨酸的蛋白質，即MARCH10b缺少泛素連接酶活性。MARCH10b在C末端區富含脯氨酸序列，表明其介導蛋白質與蛋白質相互作用，例如，與Src同源3、WW和EVH1域發生相互作用，因此，MARCH10b可充當適配器或支架蛋白的作用。

2.2.3 MARCH11 MARCH11含約402個氨基酸，相對分子質量約為4.4×104，高表達于睪丸，可能在精子形成期和精子鞭毛形成中發揮重要作用[9]。MARCH11主要表達于發育中的精子細胞，在腦和垂體也有少量表達，定位于胞質泡膜、早期內涵體膜。在早期圓形精子細胞中，MARCH11定位于反面高爾基體管網狀結構(TGN)和MVB，能泛素化精子形成期相關多拷貝跨膜(SAMT)蛋白，使其傳遞到晚期胞內體/溶酶體區室。SAMT家族蛋白是MARCH11的底物，MARCH11在小鼠精子細胞通過泛素連接酶活性將其經TGN-MVB通路遞送至溶酶體，可能參與哺乳動物精子發生[9,22]。此外，CD4是MARCH11的另一底物[9]。

2.3 MARCH5及其與線粒體相關 MARCH5，是一種線粒體泛素連接酶，又稱MITOL，含約273個氨基酸，相對分子質量約為3.1×104。MITOL擁有一個負責泛素連接酶活性的植物同源域(PHD)基序和4個跨膜域，可在腦、心臟、肝、肺、脾、胃、睪丸、骨和肌肉表達，定位于線粒體外膜和內質網膜，能分別通過降解線粒體分裂蛋白hFis1和Drp1、線粒體融合蛋白mitofusin1(Mfn1)和mitofusin2(Mfn2),以及微管相關蛋白1B(MAP1B)而對包括線粒體形態、運輸、與內質網的相互作用等線粒體動力學起關鍵性作用[6]。MARCH5作為Mfn1上游調控者，通過調控乙酰化Mfn1，阻止在應激狀態下過量Mfn1集聚，對維持線粒體穩態和細胞存活至關重要。MARCH5沉默細胞會表現出線粒體形態畸形。MARCH5缺失可導致線粒體伸長，通過阻斷Drp1活性和(或)促進Mfn1在線粒體的積聚而誘導細胞衰老，因此，MARCH5作為線粒體質量控制的調節器，可能在預防細胞衰老中發揮作用[23]。Yonashiro等[24]證實MITOL能阻斷S-亞硝基MAP1B-輕鏈1(LC1)介導的線粒體功能障礙與神經元細胞死亡。MARCH5能與線粒體的Mfn2相互作用，但不能與內質網的Mfn2相互作用。Mfn2的GTP酶域的K192是MARCH5主要的泛素化位點，MITOL通過使該位點泛素化來激活Mfn2，從而調控內質網-線粒體的相互作用。由此推測MARCH5可能通過調控Mfn2而參與神經退行性疾病的發病機制。MITOL泛素化SOD1突變體并減少SOD1突變所致活性氧產生，從而對線粒體起保護作用。MITOL能直接泛素化，并通過泛素-蛋白酶體通路促進線粒體多聚谷氨酰胺polyQ的降解，從而控制polyQ聚集體形成和細胞毒性，由此推測MITOL可以作為治療polyQ疾病的潛在靶點。

2.4 MARCH6及其與降脂相關 內質網E3泛素連接酶MARCH6，又稱釀酒酵母Doa10或在人也稱TEB4，含約910個氨基酸，相對分子摶量約為1.03×104，定位于內質網膜和多通道膜，參與內質網相關蛋白的降解。Doa10能通過RING結構域與泛素結合酶Ubc7相互作用，調控E2的降解。Doa10/Teb4能通過調控角鯊烯單加氧酶(SM)的降解，以達到甾醇體內平衡。研究發現Erg1(SM的同源物)是酵母中Doa10的底物，Doa10依賴Erg1的降解受羊毛甾醇所調控，高水平的lanosterol促使Erg1的降解。但在哺乳動物細胞中，是膽固醇刺激TEB4介導的SM降解，影響3-羥基-3-甲基戊二輔酶A還原酶和膽固醇合成途徑，從而為TEB4靶向治療高脂血癥提供了可能[3]。

3 展 望

MARCH家族作為E3泛素連接酶新近發現的一類，在調節許多生物過程中起著重要作用，其異常表達會導致某些疾病(如免疫功能異常、雄性不育、線粒體功能異常、高脂血癥等)的發生。MARCH家族決定了泛素-蛋白酶體通路底物的特異性，因此，高通量識別底物將是今后研究的主要方向。隨著MARCH家族蛋白相關領域研究的不斷深入，其關鍵性的新功能不斷被發現，其重要性將日益受到更為廣泛的關注。總之，深入研究MARCH家族，無論對于相關疾病發病機制的研究，還是對于這些疾病臨床治療和藥物的開發皆具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.039

國家自然科學基金資助項目(81300535)；重慶市科委自然科學基金資助項目(cstc2013jcyjA10075)。 作者簡介：王美姣(1983-)，醫師，碩士，主要從事生殖醫學與生殖生物學研究。△

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1671-8348(2016)29-4144-04

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