納米雄黃對卵巢癌細胞COC1凋亡的影響*

馬淑云，高尚風，吳勝軍，張少華，陳 蕊，王 莉，徐 銳

(1．西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科，西安 710077；2．西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061；3．西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院科研科，西安 710077)

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論著·基礎(chǔ)研究

納米雄黃對卵巢癌細胞COC1凋亡的影響*

馬淑云1，高尚風2，吳勝軍1，張少華1，陳 蕊1，王 莉3，徐 銳3

(1．西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科，西安 710077；2．西安交通大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，西安 710061；3．西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院科研科，西安 710077)

目的 探討納米雄黃對卵巢癌細胞COC1的凋亡作用。方法 0.6μmol/L濃度的納米雄黃作用于COC1細胞，于不同時間收集的細胞。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測細胞凋亡率，RT-PCR檢測細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA的表達水平，蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達水平。結(jié)果 0.6μmol/L濃度的納米雄黃作用于COC1細胞48h后出現(xiàn)顯著的凋亡形態(tài)改變；納米雄黃顯著的促進細胞凋亡，并隨著納米雄黃處理COC1細胞時間的延長凋亡率顯著性增加(P<0.05)；隨著納米雄黃處理間的延長COC1細胞中的Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)，Bcl-2的mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 納米雄黃對COC1細胞有顯著的促凋亡作用，其作用機制可能與升高Bax和Caspase-3的表達和降低Bcl-2的表達有關(guān)。

納米雄黃；COC1細胞；Bax；Bcl-2；Caspase-3

目前，因卵巢癌而死亡的女性排在所有女性惡性腫瘤的首位。近年來臨床醫(yī)生對卵巢癌的治療主要是采用以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療，但隨著卵巢惡性腫瘤細胞對鉑類化療藥物出現(xiàn)不同程度的耐藥性，使以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療效果十分不理想[1]。雄黃是我國中醫(yī)藥常用的一種含有砷的化合物，有學者研究表明雄黃對白血病有顯著的療效[2-3]。采用納米技術(shù)處理得到的納米雄黃相對于雄黃具有溶解性高、毒性降低的特點。然而，關(guān)于雄黃抑制卵巢癌惡性腫瘤細胞增殖和促進其凋亡的作用機制尚不清楚。有研究表明Bax、Bcl-2和Caspase-3在組織細胞的增殖和凋亡的過程中起著非常重要的要用[4-5]。因此，本文觀察納米雄黃作用卵巢癌細胞COC1后，觀察COC1的凋亡作用和Bax、Bcl-2和Caspas-3表達水平的變化，以探究雄黃抑制卵巢癌惡性腫瘤細胞增殖和促進其凋亡的作用機制，為尋找到有效治療卵巢癌的新藥物提供更充足的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人黏液性卵巢惡性腫瘤細胞株COC1由西安交通大學第一附屬醫(yī)院中心實驗室友情提供，COC1細胞采用半鐵壁懸浮培養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 PRMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程有限公司)，Bax、Bcl-2和Caspas-3抗體(美國Biowoelde公司)，二抗(美國Rockland公司)，雄黃(西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液科友情提供)。精細研磨機(山東龍脈科技公司)，光子相關(guān)納米激光粒度分析儀(濟南微納顆粒儀器公司)，垂直電泳槽(瑞典Hoefer Amersham Biosciences公司)，酶標儀(Bio-TEK公司)，流式細胞儀(美國Becton Dickinson 公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及培養(yǎng) 實驗共分為平行對照組和納米雄黃組。平行對照組常規(guī)培養(yǎng)，無藥物干預(yù)；納米雄黃組常規(guī)培養(yǎng)，用納米雄黃濃度為0.6μmol/l小牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24、48、72h后收COC1卵巢惡性腫瘤細胞。

1.3.2 納米雄黃的制備 將西安交通大學第一附屬醫(yī)院血液科提供的雄黃采用精細研磨機進行研磨，研磨之后采用光子相關(guān)納米激光粒度分析儀測定研磨后的雄黃顆粒的粒徑分布和尺寸的大小。以研磨后的雄黃顆粒平均粒徑小于或等于72.79nm作為研磨合格的標準。將研磨處理好的納米雄黃用不含有小牛血清的培養(yǎng)基進行攪拌溶解，經(jīng)原子吸收分光光度計檢測濃度為62.4μmol/L，作為儲備納米雄黃液。在使用的過程中用含有10%濃度的小牛血清的培養(yǎng)基稀釋配制。

1.3.3 COC1細胞培養(yǎng)和納米雄黃處理 對COC1卵巢惡性腫瘤細胞采用半貼壁懸浮培養(yǎng)，將COC1細胞在含有10%濃度小牛血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用含有10%體積濃度的小牛血清的培養(yǎng)基對納米雄黃儲備液進行稀釋以配制工作液，配制的納米雄黃的工作液濃度為0.6μmol/L。當0.6μmol/L濃度的納米雄黃與COC1卵巢惡性腫瘤細胞作用24、48和72h后收集COC1卵巢惡性腫瘤細胞。

1.3.4 COC1細胞凋亡及細胞周期分析 使用FITC-Annexin V-PI雙染流式細胞術(shù)對COC1細胞凋亡進行檢測，主要步驟為：收集兩株生長周期處于對數(shù)期的COC1細胞，將COC1的細胞濃度稀釋為1×106個/瓶于50mL的培養(yǎng)瓶中，加入適當量的納米雄黃溶液，配制成0.6μmol/L濃度的工作液。分別培養(yǎng)24、48、72h，收集COC1細胞。用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，參照ITC-Annexin V-PI雙染試劑盒上的說明，加入相應(yīng)的試劑，低溫避光30min，加入結(jié)合液之后在流式細胞儀中檢測COC1細胞的凋亡。

1.3.5 COC1細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達水平的檢測 使用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測COC1細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達水平。主要步驟為：收集經(jīng)過0.6μmol/L濃度納米雄黃工作液處理了24、48、72h后COC1細胞，使用裂解強度中等的RIPA裂解液對收集的COC1細胞進行裂解以提取COC1細胞的總蛋白，使用BCA對提取的總蛋白進行蛋白定量，加入適量的上樣緩沖液，取每孔60～80μg蛋白在10%的分離膠中對總蛋白進行電泳分離，將電泳分離后的Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白轉(zhuǎn)移至醋酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，在1∶1000的Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體和1∶400的β-actin 抗體中4℃條件下孵育過夜，PBST洗膜3次，每次10min，在1∶3000的二抗中孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min，在目的蛋白出涂布ECL發(fā)光試劑，在暗室中曝光，用Autogel 圖像分析軟件對曝光的條帶進行分析，比較目的蛋白和β-actin的灰度值。實驗重復(fù)3次。

1.3.6 COC1細胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達水平的檢測 收集不同時間的COC1細胞，以400r/min離心10min，收集離心后的細胞，按照RNA提取試劑的操作說明提取每個時間點的細胞中的RNA，檢測提取的RNA水平和純度；參照RT-PCR操作說明檢測各時間點COC1細胞中的Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 納米雄黃對卵巢癌細胞COC1凋亡細胞形態(tài)的影響 卵巢癌細胞COC1經(jīng)過0.6μmol/L濃度的納米雄黃處理24h后，細胞開始出現(xiàn)凋亡形態(tài)學的改變。但此時的細胞是圓形，細胞的體積沒有出現(xiàn)顯著縮小，胞核和胞質(zhì)的邊界還未完全分清，多數(shù)的COC1細胞僅能觀察到深色的細胞核；處理48h后COC1細胞凋亡陽性的細胞數(shù)開始增加，細胞形態(tài)呈現(xiàn)為非圓形，體積開始顯著的縮小，胞質(zhì)和胞核的邊界分清。而在相同的細胞培養(yǎng)時間內(nèi)，未被納米雄黃處理的COC1細胞仍然呈現(xiàn)為半貼壁生長，COC1細胞的體積大，觀察不到明顯的細胞核形態(tài)，細胞核呈現(xiàn)為均勻性的淡染，沒有特異性的染色,見圖1。

2.2 兩組卵巢癌細胞COC1凋亡率比較 納米雄黃組干預(yù)24、4872h的凋亡率顯著高于平行對照組干預(yù)相同時間的凋亡率(P<0.05)；納米雄黃組中干預(yù)72和48h的凋亡率顯著高于干預(yù)24h的凋亡率(P<0.05)；納米雄黃組中干預(yù)72h的凋亡率顯著高于干預(yù)48h的凋亡率(P<0.05),見表1。

表1 兩組卵巢癌細胞COC1凋亡率比較(%)

2.3 納米雄黃對卵巢癌細胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3mRNA表達的影響 納米雄黃組COC1細胞中的Bax mRNA和Caspase-3mRNA表達隨著干預(yù)時間的延長而顯著增加(P<0.05)；COC1細胞中的Bcl-2mRNA表達隨著干預(yù)時間的延長而顯著降低(P<0.05)，見圖2。

*:P<0.05，與干預(yù)24h比較；#:P<0.05，與干預(yù)48h比較

2.4 納米雄黃對卵巢癌細胞COC1中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達的影響 納米雄黃組COC1細胞中的Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達隨著干預(yù)時間的延長而顯著增加(P<0.05)；COC1細胞中的Bcl-2蛋白表達隨著干預(yù)時間的延長而顯著降低(P<0.05)，見圖3。

*:P<0.05，與干預(yù)24h比較；#:P<0.05，與干預(yù)48h比較

3 討 論

卵巢惡性腫瘤是嚴重威脅女性生命安全的一種惡性腫瘤，目前已是女性三大惡性腫瘤之一。目前，對卵巢癌的治療主要是以鉑類化療藥物為基礎(chǔ)的化療治療，這種治療方法在早期時可以收到顯著的臨床效果，但隨著卵巢惡性腫瘤細胞對這些化療藥物的耐受性增加，敏感性降低，在后期治療過程中臨床效果顯著降低，達不到理想的治療效果。硫化物類的化療藥物患有砷元素，在臨床上除了具有解毒殺蟲、燥濕祛痰、截瘧等作用外，還具有治療慢性粒細胞性白血病等抗腫瘤的作用[6]。目前大多數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，雄黃主要對血液系統(tǒng)的惡性腫瘤具有抗腫瘤的作用[7]。雄黃抗腫瘤的主要作用機制主要有以下幾點：(1)抑制惡性腫瘤細胞的增殖；(2)促進惡性腫瘤細胞的凋亡；(3)抑制實體腫瘤中的血管新生[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，納米雄黃對卵巢癌細胞COC1具有顯著的促凋亡作用，COC1細胞在0.6μmol/L濃度的納米雄黃的作用下細胞形態(tài)會發(fā)生顯著的凋亡變化，并且隨著納米胸花處理時間的延長，細胞凋亡形態(tài)的變化更嚴重。在本研究中的流式細胞儀檢測凋亡結(jié)果表明0.6μmol/L納米雄黃對COC1細胞的凋亡具有促進的作用，并且隨著納米雄黃處理COC1細胞時間的延長，COC1細胞的凋亡率會顯著增高，這些結(jié)果表明納米雄黃對卵巢癌細胞COC1具有促進凋亡的作用。黃嬌娥等[10]研究發(fā)現(xiàn)，雄黃對人的肝癌細胞Bel-7402具有促進凋亡的作用。本研究結(jié)果和其研究結(jié)果表明，納米雄黃除了對血液系統(tǒng)的惡性腫瘤細胞具有抗腫瘤的作用之外，對包括卵巢癌在內(nèi)的實體瘤也具有顯著的抗腫瘤的作用，可以探索雄黃治療包括卵巢癌在內(nèi)的實體瘤的治療。

隨著對抗腫瘤藥物機制研究的深入，醫(yī)學界發(fā)現(xiàn)多數(shù)的抗腫瘤藥物主要是通過調(diào)節(jié)促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白水平的變化來實現(xiàn)抗腫瘤的作用[11-12]。Bcl-2是機體中重要的抑制凋亡的基因，通過編碼相應(yīng)的蛋白來抑制細胞色素C從細胞中線粒體內(nèi)釋放達到抗凋亡的作用[13]。Bax是機體中重要的促凋亡基因，通過編碼相應(yīng)的蛋白達到促進惡性細胞凋亡的作用[14]。但Bcl-2編碼的凋亡抑制蛋白增多會與Bax結(jié)合抑制惡性腫瘤細胞的凋亡。當Bcl-2/Bax比值發(fā)生變化時會調(diào)節(jié)凋亡蛋白Caspase-3的表達，進而決定促進腫瘤細胞凋亡或抑制腫瘤細胞凋亡[15]。本研究RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果表明，隨著0.6μmol/L濃度的納米雄黃處理卵巢癌細胞COC1時間的延長，Caspase-3和Bax的mRNA和蛋白表達量顯著增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA和蛋白的表達量顯著降低。該結(jié)果表明納米雄黃促進卵巢癌細胞COC1凋亡的作用機制是通過將Bcl-2/Bax比值偏向Bax，進而促進促凋亡因子Caspase-3的表達量增加，最終達到促進COC1細胞凋亡的作用。

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Apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1*

Ma Shuyun1，Gao Shangfeng2，Wu Shengjun1，Zhang Shaohua1， Chen Rui1， Wang Li3,Xu Rui3

(1.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China;2.Department of Gynecology and Obstertrics,the First Hospital of Medicine School of Xi′anJiaotong University，Xi′an，Shaanxi 710061，China;3.Research Service Office,the First Affiliated Hospital of Xi′anMedical College，Xi′an，Shaanxi 710077，China)

Objective To explore the apoptosis induced by nanoparticles in ovarian cancer COC1.Methods 0.6μmol/L concentration treated cells COC1,cells were collected at different times.Cell morphology was observed under an inverted microscope,rate of apoptosis were detected by flow cytometry.RT-PCR to detect the mRNA expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3in the COC1cells.Western blot to detect the protein expression of Bax,Bcl-2and Caspase-3.Results Significant apoptotic morphological changes nanoparticles 0.6μmol/L concentration appear to COC1cells after 48h;nanoparticles significantly promoted apoptosis and prolonged treatment with nanoparticles COC1cell apoptosis rate significantly increased time (P<0.05);with the extension of nanoparticles COC1cell treatments in the Bax and mRNA and protein expression levels of Caspase-3was significantly increased (P<0.05),mRNA and protein expression levels of Bcl-2was significantly decreased (P<0.05).Conclusion Nanoparticles on COC1cells have significant pro-apoptotic effect.The mechanism of action may be related to increased expression of Bax and Caspase-3,decreased expression of Bcl-2.

nanorealgar;COC1cell;Bax;Bcl-2;Caspase-3

10.3969/j.issn.1671-8348.2016.29.003

陜西省自然科學基金資助項目(2012JM4051)。 作者簡介：馬淑云(1974-),副主任醫(yī)師，在讀博士，主要從事婦科腫瘤方面的研究。

R711.7

A

1671-8348(2016)29-4041-03

2016-02-22

2016-04-09)