Nec-1在小鼠腦出血中通過抑制程序性壞死發(fā)揮神經(jīng)保護作用

常 盼， 于 軍， 張明陽， 朱妙章， 鐵 茹， 張學(xué)策， 趙海康， 單海燕

?

Nec-1在小鼠腦出血中通過抑制程序性壞死發(fā)揮神經(jīng)保護作用

常 盼1，3， 于 軍1， 張明陽2， 朱妙章3， 鐵 茹1， 張學(xué)策1， 趙海康4， 單海燕5

目的 研究程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對小鼠腦出血神經(jīng)功能的保護作用，并探討其機制。方法 選取健康雄性ICR小鼠，體重25～30 g，采用在紋狀體部位注射膠原酶Ⅳ或生理鹽水的方法建立小鼠腦出血組或者腦出血對照組，在腦出血前15 min 分別在側(cè)腦室注射Nec-1溶液或vehicle溶液。將實驗隨機分為：對照組、腦出血+vehicle處理組、腦出血+ Nec-1處理組。分別利用干濕重法測定腦水腫程度，神經(jīng)功能評分檢測神經(jīng)運動功能，Western blotting檢測cleaved caspase-3，Bcl-2蛋白表達情況。結(jié)果 腦出血加劇腦水腫程度，而 Nec-1處理組減輕腦水腫程度(P<0.05)。經(jīng)Nec-1處理后，可以提高小鼠腦出血神經(jīng)運動功能(P<0.05)。腦出血可以增加cleaved caspase-3蛋白表達，抑制Bcl-2蛋白表達，經(jīng) Nec-1處理后，抑制cleaved caspase-3的表達水平(P<0.05)，增加Bcl-2的表達 (P<0.05)。結(jié)論 Nec-1對腦出血發(fā)揮重要神經(jīng)保護作用，這種保護作用可能是通過抑制凋亡通路實現(xiàn)的，提示程序性壞死在腦出血中具有重要作用，將為腦出血的治療提供新的思路。

Nec-1； 腦出血； 程序性壞死； cleaved caspase-3； Bcl-2

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一個嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題，占所有住院腦卒中患者的10%～30%，具有很高的病死率和致殘率，6 m的病死率達30%～50%[1，2]。腦出血后的腦損傷機制很復(fù)雜，目前腦出血的治療沒有突破性進展。程序性壞死作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，參與多種神經(jīng)損傷疾病中，但在腦出血中的作用仍不清楚。有研究者發(fā)現(xiàn)程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦缺血中腦組織梗死體積[3，4]，除此之外，Nec-1能夠減小腦外傷后的細(xì)胞損傷數(shù)，甚至可以改善腦外傷引起的神經(jīng)功能障礙[5]，但Nec-1對腦出血的作用仍不清楚，且Nec-1發(fā)揮神經(jīng)作用的機制仍未見報道。

為此，本研究擬通過檢測Nec-1對小鼠腦出血神經(jīng)功能的影響，以及其對凋亡的影響，研究Nec-1對小鼠腦出血神經(jīng)作用及其相關(guān)機制，旨在為進一步研究腦出血的治療方案提供新靶點，以期為腦出血的生理病理機制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑 ICR小鼠由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物實驗中心提供。膠原酶IV(collagenase IV)、caspase-3、Bcl-2購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 腦出血模型建立 小鼠稱重后麻醉，參照Wang等人 方法，剝離右側(cè)顱頂骨膜，固定于小鼠腦立體定位儀上，用顱骨鉆刺一小孔，微量進樣器于左側(cè)紋狀體內(nèi)注射膠原酶IV，深度為3.5 mm，于5 min內(nèi)均勻注入后，留針5 min，然后拔針。

1.3 實驗分組 6～8 w齡ICR小鼠(25～30 g)隨機分成未處理組，處理組(Veh組、Nec-1組)，處理組每組分為24 h和72 h，每組6只，于出血前側(cè)腦室分別注射DMSO溶劑或者Nec-1溶劑。

1.4 腦水腫的測定 腦水腫的程度可以用腦組織含水量來表示。小鼠出血后分別在24 h和72 h斷頭取腦后，迅速取出腦組織，去除嗅球和腦干，放于水平面，然后沿正中線切開，分離腦皮質(zhì)和紋狀體。小腦作為參考標(biāo)準(zhǔn)也予以測重。分離得到5部分腦組織：傷側(cè)及對側(cè)腦皮質(zhì)，傷側(cè)及對側(cè)紋狀體，小腦。迅速將腦組織放到電子精密天平上稱重得到腦組織的濕重，并記錄，隨后，將腦組織放入100 ℃的烘箱內(nèi)，24 h后取出腦組織并測量干重。腦組織含水量(%)的計算方法如下：(濕重-干重)/濕重×100。

1.5 神經(jīng)運動功能的檢測 運動功能在出血前1 d及出血后1～7 d 進行檢測。將實驗小鼠的尾巴用手抓住，讓它的兩個前爪抓住線的中間，每只小鼠從前部、左側(cè)及右側(cè)3個不同的方向重復(fù)操作3次，按照評分標(biāo)準(zhǔn)，記錄分?jǐn)?shù)，并計算平均分。

1.6 腦組織中caspase-3、Bcl-2蛋白表達量的測定 分別在腦出血后24 h 和72 h，將各組小鼠用水合氯醛麻醉，斷頭取腦，在腦模中按統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)取出血腦組織，加入組織裂解液，超聲細(xì)胞破碎儀低溫勻漿，抽取上清，BCA法測蛋白含量后，進行Western blotting實驗。

2 結(jié) 果

2.1 Nec-1對腦出血后腦水腫的影響 在腦出血24 h后，Nec-1組與vehicle組相比，可以減少出血側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)腦水腫的程度(P<0.05)，而對側(cè)皮質(zhì)和基底節(jié)腦水腫程度無差異，小腦的水腫程度也未改變。表明經(jīng)Nec-1處理后可以減輕腦出血后的腦水腫程度(見圖1)。

2.2 Nec-1對腦出血后神經(jīng)運動功能的影響 腦出血后1 w內(nèi)小鼠運動功能減退，Nec-1處理后有助于提高出血后神經(jīng)運動功能的恢復(fù)(P<0.05)。表明經(jīng)Nec-1處理有助于提高腦出血后神經(jīng)運動功能的恢復(fù)(見圖2)。

2.3 Nec-1對腦出血后cleaved caspase-3(CC3)表達的影響 腦出血24 h和48 h后CC3表達增加(P<0.05)，Nec-1處理后降低CC3的表達(P<0.05)，表明Nec-1可以降低腦出血后CC3的表達(見圖3)。

2.4 Nec-1對腦出血后Bcl-2表達的影響 腦出血24 h 和48 h后抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低(P<0.05)，而Nec-1處理組可以增加Bcl-2蛋白的表達量(P<0.05)，表明Nec-1可以增加腦出血后Bcl-2蛋白的表達(見圖4)。

與同部位Veh組比較*P<0.05

與Con組比較#P<0.05；與Veh組比較*P<0.05

與同部位Veh組比較*P<0.05

圖3 Nec-1對腦出血后cleaved caspase-3(CC3)蛋白表達的影響

與Con組比較#P<0.05；與Veh組比較*P<0.05

3 討 論

隨著我國社會人口老齡化加快，腦出血已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病之一。盡管有關(guān)腦出血后神經(jīng)細(xì)胞死亡的機制得到深入研究，但迄今為止，臨床上腦出血的治療沒有突破性進展。腦出血后的腦損傷機制很復(fù)雜，其中包括最初的物理損傷和血腫的占位效應(yīng)所引起的原發(fā)性損傷，以及繼發(fā)性損傷如血腦屏障的破壞、腦水腫、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)細(xì)胞的死亡等[1，6]。現(xiàn)已證實，多種細(xì)胞死亡方式都存在于腦出血的損傷中，但是具體機制仍不清楚。為了提供新的有效的治療方法，探究腦出血后誘導(dǎo)的大腦損傷的病理機制尤其是細(xì)胞死亡方式十分重要。

在細(xì)胞的生命周期中，死亡是一個不可避免而又極其重要的環(huán)節(jié)。細(xì)胞的增殖和死亡之間的動態(tài)平衡對于多細(xì)胞生物的發(fā)育，以及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的維持都是非常重要的，一旦這種平衡被打破，就會導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常、癌癥、自身免疫性疾病和退行性疾病等疾病的發(fā)生。因此，多細(xì)胞生物在進化過程中逐漸形成了一套復(fù)雜而精密的調(diào)節(jié)機制來維持這種平衡。細(xì)胞死亡不僅是細(xì)胞的最終命運，而且它如同細(xì)胞分裂、增殖一樣，在整個機體的生長、發(fā)育中具有不可替代的作用。隨著對細(xì)胞死亡機制的深入研究，細(xì)胞死亡的方式有多種，關(guān)于細(xì)胞死亡的分類目前并不統(tǒng)一，但普遍將受基因調(diào)控、高度有序、主動的細(xì)胞死亡方式稱為程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。越來越多的證明表明，部分細(xì)胞壞死也是程序性細(xì)胞死亡方式中重要的一種[7]。

細(xì)胞壞死是機體免疫抵御的重要組成部分，也是機體應(yīng)對損傷時用于清理損傷細(xì)胞的重要方式，細(xì)胞壞死途徑會通過激活炎性反應(yīng)來清除受損細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)容物。但過量的細(xì)胞壞死會使得炎性反應(yīng)不斷擴大，從而造成不可逆轉(zhuǎn)的組織損傷甚至導(dǎo)致機體的死亡。人們對壞死的認(rèn)識不斷出現(xiàn)新證據(jù)，不僅表明細(xì)胞壞死不同于細(xì)胞凋亡，而且可以由信號途徑介導(dǎo)。2005年哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院袁均英教授的課題組，發(fā)現(xiàn)一種小分子物質(zhì)Nec-1，可以特異性的抑制細(xì)胞壞死，并將這一種細(xì)胞死亡方式命名為程序性壞死(necroptosis)[8]。研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死是一種受基因調(diào)控、高度有序、主動的細(xì)胞死亡形式，受體相互作用蛋白激酶1( receptor interaction protein kinase 1，RIP 1)和受體相互作用蛋白激酶3(receptor interaction protein kinase 3，RIP 3 )是其關(guān)鍵的調(diào)控因子[7，9]。更重要的是越來越多的證據(jù)，不僅表明細(xì)胞壞死可以由信號途徑介導(dǎo)，而且還被發(fā)現(xiàn)參與到缺血性心腦血管疾病和神經(jīng)退行性等疾病的病理過程。例如，有研究者發(fā)現(xiàn)，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦缺血中腦組織梗死體積[3，4]。除此之外，Nec-1能夠可以減小腦外傷后的細(xì)胞損傷數(shù)[5]，甚至可以改善腦外傷引起的神經(jīng)功能障礙，這些結(jié)果提示，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對神經(jīng)細(xì)胞的損傷具有保護作用。可見，程序性壞死這種細(xì)胞死亡方式在各種原因引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷中具有重要的作用，抑制程序性壞死對神經(jīng)系統(tǒng)疾病及神經(jīng)損傷起到保護作用。因此，闡明程序性壞死的分子機制以及研發(fā)有效的抑制劑是非常必要的，為制定有效的治療策略提供強有力的科學(xué)依據(jù)。

在本研究中，通過在紋狀體注射膠原酶IV建立腦出血模型，由于腦出血后的機制非常復(fù)雜，其中血腫周邊的腦水腫是腦出血后最嚴(yán)重的繼發(fā)性損傷之一，它的發(fā)生和發(fā)展是導(dǎo)致腦出血病情發(fā)展和惡化的重要原因之一[10，11]。因此本研究首先檢測Nec-1對腦出血后腦水腫程度的影響，通過觀察腦出血24 h后Nec-1給藥組和DMSO溶劑對照組腦水腫的變化，發(fā)現(xiàn)Nec-1可以減少腦水腫程度。為了進一步研究Nec-1對腦出血后的作用，我們應(yīng)用行為學(xué)實驗方法，檢測Nec-1對腦出血后神經(jīng)功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nec-1有助于腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。這些結(jié)果提示，Nec-1對腦出血具有神經(jīng)保護作用，有助于腦出血后神經(jīng)功能的恢復(fù)。

然而，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1對神經(jīng)系統(tǒng)疾病尤其是腦出血的作用機制仍不清楚，為了研究Nec-1對腦出血的作用及機制，在本次研究中，我們通過檢測凋亡蛋白CC3和抗凋亡蛋白Bcl-2。結(jié)果顯示腦出血后CC3蛋白表達上升，Bcl-2蛋白水平降低，而Nec-1處理后抑制腦出血后CC3的蛋白表達的上升，而且上調(diào)Bcl-2的表達量。凋亡作為一種很重要的程序性細(xì)胞死亡方式，已經(jīng)有文章報道，凋亡發(fā)生于腦出血中[12，13]，部分研究也證明抑制凋亡在腦出血中發(fā)揮保護性作用[14，15]，說明細(xì)胞凋亡現(xiàn)象在腦出血的病理學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2蛋白可以促使細(xì)胞色素C釋放進入胞漿，啟動caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16，17]。細(xì)胞內(nèi)雖然存在多種信號傳導(dǎo)途徑，不同的凋亡信號的刺激可激活多種caspase，但最終都能導(dǎo)致caspase-3的激活，從而引起細(xì)胞凋亡。結(jié)合以上結(jié)果，提示Nec-1可能通過抑制凋亡的發(fā)生，而發(fā)揮其對腦出血的保護作用。同時，也說明在腦出血損傷中，程序性壞死是不同于凋亡的另一種重要細(xì)胞死亡方式。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在腦出血中，程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1可以減少腦出血后腦水腫程度，而且可以提高神經(jīng)運動功能，同時Nec-1抑制凋亡蛋白CC3的表達，而增加抗凋亡蛋白Bcl-2。這些結(jié)果強烈提示Nec-1對腦出血具有重要的神經(jīng)保護作用，多種細(xì)胞死亡方式參與腦出血的損傷機制中，抗凋亡途徑可能是Nec-1在腦出血中發(fā)揮保護作用的機制之一，而且程序性壞死可能存在于凋亡的上游，因此其作為一種重要的細(xì)胞死亡方式，參與腦出血損傷中。程序性壞死的特異性抑制劑Nec-1具有廣泛的應(yīng)用前景，不僅有助于進一步闡明程序性壞死的分子機制，而且對于神經(jīng)損傷性疾病新治療策略的發(fā)展都有著極其重要的意義。

本研究發(fā)現(xiàn)程序性壞死細(xì)胞死亡途徑，不僅發(fā)生在腦出血中，而且是可以被調(diào)控的。進一步我們推測程序性壞死可能是腦出血細(xì)胞死亡類型中重要方式之一，程序性壞死可能存在于細(xì)胞凋亡的上游，抑制程序性壞死可能成為腦出血防治的重要途徑，抗凋亡有可能成為治療腦出血的一種方法。另一方面，發(fā)展有效的抑制劑不僅有利于研究此信號途徑的調(diào)控機制，而且將為腦出血等疾病的治療提供新的方案，還可能將揭示細(xì)胞程序性死亡途徑中新的作用蛋白。更重要的是，化學(xué)抑制劑都是潛在的藥物，進一步的機制研究和改良以及在動物疾病模型上的深入探討都有可能幫助其發(fā)展成為臨床藥物，這將為腦出血等疾病提供新的治療手段。

[1]Keep RF，Hua Y，Xi G. Intracerebral haemorrhage：mechanisms of injury and therapeutic targets [J]. Lancet Neurol，2012，11(8)：720-731.

[2]Balami JS，Buchan AM. Complicationsof intracerebral haemorrhage[J]. Lancet Neurol，2012，11(1)：101-118.

[3]Yin B，Xu Y，Wei RL，et al. Inhibition of receptor-interacting protein 3 upregulation and nuclear translocation involved in Necrostatin-1 protection against hippocampal neuronal programmed necrosis induced by ischemia/reperfusion injury[J]. Brain Res，2015，1609：63-71.

[4]Linkermann A，Br?sen JH，Himmerkus N，et al. Rip1 (receptor-interacting protein kinase 1) mediates necroptosis and contributes to renal ischemia/reperfusioninjury[J]. Kidney Int，2012，81(8)：751-761.

[5]Wang YQ，Wang L，Zhang MY，et al. Necrostatin-1 suppresses autophagy and apoptosis in mice traumatic brain injury model[J]. Neurochem Res，2012，37(9)：1849-1858.

[6]Chen S，Yang Q，Chen G，et al. An update on inflammation in the acute phase of intracerebral hemorrhage[J]. Transl Stroke Res，2015，6(1)：4-8.

[7]Linkermann A，Green DR. Necroptosis[J]. N Engl J Med，2014，70(5)：455-465.

[8]Degterev A，Huang Z，Boyce M，et al. Chemical inhibitor of nonapoptotic cell death with therapeutic potential for ischemic brain injury[J]. Nat Chem Biol，2005，1(2)：112-119.

[9]Feoktistova M，Leverkus M. Programmed necrosis and necroptosis signalling[J]. FEBS J，2015，282(1)：19-31.

[10]Adeoye O，Clark JF，Khatri P，et al. Do current animal models of intracerebral hemorrhage mirror the human pathology[J]. Translational Stroke Research，2011，2(1)：17-25.

[11]Keep RF，Zhou N，Xiang J，et al. Vascular disruption and blood-brain barrier dysfunction in intracerebral hemorrhage[J]. Fluids Barriers CNS，2014，10：11-18.

[12]LoPresti MA，Bruce SS，Camacho E，et al. Hematoma volume as the major determinant of outcomes after intracerebral hemorrhage[J]. J Neurol Sci，2014，345(1/2)：3-7.

[13]Chen JC. The effects of acupuncture and traditional Chinese medicines on apoptosis of brain tissue in a rat intracerebral hemorrhage model[J]. Physiol Behav，2015，151：421-425.

[14]Wang T，Huang Y，Zhang M，et al. [Gly14]-Humanin offers neuroprotection through glycogen synthase kinase-3beta inhibition in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J]. Behav Brain Res，2013，247：132-139.

[15]Sun H，Tang Y，Li L，et al. Effects of local hypothermia on neuronal cell apoptosis after intracerebral hemorrhage in rats[J]. J Nutr Health Aging，2015，19(3)：291-298.

[16]Serasinghe MN，Missert DJ，Asciolla JJ，et al. Anti-apoptotic BCL-2 proteins govern cellular outcome following B-RAF(V600E) inhibition and can be targeted to reduce resistance[J]. Oncogene，2015，34(7)：857-867.

[17]Chipuk JE. BCL-2 proteins：melanoma lives on the edge [J]. Oncoscience，2015，2(9)：729-730.

The role and mechanism of Nec-1 after intracerebral hemorrhage in mice

CHANG Pan，YU Jun，ZHANG Mingyang，et al.

(Central Laboratory，Second Affiliated Hospital of Xi’an Medical College，Xi’an 710038，China)

Objective To investigate the influence of Nec-1，a specific necroptosis inhibitor，on neurofunction after intracerebral hemorrhage and underlying mechanism. Methods Male ICR mice (25～30g) received an infusion of collagenase type IV to induce ICH (intracerebral hemorrhage) or saline as control into the left striatum. Nec-1 and vehicle were pretreated with a single intracerebroventricular (i. c. v. ) injection into the ipsilateral ventricle 15 min before ICH，respectively. Those mice were randomizes into three groups，control group，ICH and vehicle group，ICH and Nec-1 group. Then brain water content and neurological test were assessed. Meanwhile，the protein of cleaved caspase-3 and Bcl-2 were detected by Western blotting. Results Nec-1-treated group attenuated the brain water content and improved neurological function compared with vehicle group after ICH. Nec-1-treated group inhibited the cleaved caspase-3 and enhanced the Bcl-2 protein expression compared with vehicle group after ICH. Conclusion Nec-1 plays neuroprotection role via inhibition of apoptosis after ICH. Meanwhile，it shows that necroptosis has an important role after ICH，which also provides a new way for treating ICH.

Nec-1； Necroptosis； Intracerebral hemorrhage； Cleaved caspase-3； Bcl-2

1003-2754(2016)03-0196-04

2015-11-20；

2016-02-06

國家自然科學(xué)基金(No. 81301039)；中國博士后科學(xué)基金(No. 152865)；陜西省教育廳專項科研資助項目(No. 15JK1617)；蘇州市科技發(fā)展計劃項目(No. SYSD2015119)

(1.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院中心實驗室，陜西 西安 710038；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部法醫(yī)系，江蘇 蘇州 215123；3.第四軍醫(yī)大學(xué)生理學(xué)教研室，陜西 西安 710032；4.西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038；5.蘇州市立醫(yī)院北區(qū)婦產(chǎn)科，江蘇 蘇州 215008)

于 軍，E-mail：pclamper@163.com

R743.34

A