基于響應面法的海藻酸鈉固定β-呋喃果糖苷酶工藝優化

江波，米書梅*，阮征，鄧近平，黃亞霖，印遇龍,4*

（1. 南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；2. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；

3. 湖南帝億生物科技有限公司，湖南 長沙 410148；4. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南 長沙 410125）

基于響應面法的海藻酸鈉固定β-呋喃果糖苷酶工藝優化

江波1,2，米書梅1,2*，阮征1,2，鄧近平3，黃亞霖3，印遇龍1,2,4*

（1. 南昌大學食品學院，江西 南昌 330031；2. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047；

3. 湖南帝億生物科技有限公司，湖南 長沙 410148；4. 中國科學院亞熱帶農業生態研究所，湖南 長沙 410125）

糖苷酶在水解/合成生產功能性食品配料（含低聚糖）方面扮演著重要角色。為提高糖苷酶的重復利用率與穩定性，本文對影響海藻酸鈉固定化β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase, FFase）工藝的因素進行分析，利用響應面法對固定化酶工藝進行優化，最后對所得固定化酶的穩定性進行評價。結果表明：影響海藻酸鈉固定化FFase工藝的關鍵因素及最佳條件為4 g/L海藻酸鈉、固定42 min、交聯溫度26 ℃，酶活回收率為60.95%；在此條件下與游離酶相比，4 ℃下保存12 d后，酶活力依然有60%以上，具有良好的儲存穩定性；在溫度低于70 ℃范圍內有良好的熱穩定性。連續使用5次后，其固定酶活仍保持初始酶活的51.71%，具有良好的重復再利用性。關鍵詞：低聚乳果糖；呋喃果糖苷酶；酶固定化；海藻酸鈉；響應面法

糖苷酶即糖苷水解酶，在自然界廣泛存在，它能夠水解糖苷鍵，維持生物體的基本功能[1]。β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase, FFase）既能釋放糖苷底物非還原端的β-果糖基，又能夠將蔗糖中的果糖基轉移給含有羥基的受體，被廣泛用于合成功能性低聚糖[2-3]。低聚乳果糖具有多種生理功能，如抗齲齒、緩解便秘、調節腸道菌群與調節腸道免疫，在保健等方面具有重要的價值，市場應用前景廣闊[4-6]。

β-呋喃果糖苷酶本身穩定，但是容易受環境的種種不利因素影響而喪失活性。另外，很難使酶從反應體系中回收利用[7]，游離酶的使用壽命和儲存期均短。而酶的固定化技術為提高酶的使用效率、降低成本提供了可能性。由于低聚糖的快速發展，糖苷酶的固定化逐漸成為研究的熱點，其中研究最為廣泛的是離子交換法[8]、大孔弱堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂[9]、殼聚糖[10]和海藻酸鈉包埋法[11]。Chen等[10]采用磁性Fe3O4的納米微粒包被的殼聚糖作為載體對果糖苷酶的固定化進行了研究，發現固定化糖苷酶比游離糖苷酶具有更好的使用穩定性；Gon?alves等[11]研究了吸附棉、濾紙、布、甘蔗渣、繩、紗布對FFase的固定化作用，發現濾紙和繩對FFase固定化后的酶活、重復使用性和穩定性更好；Mouelhi等[12]研究了海藻酸鈉和殼寡糖對FFase的固定化效果，并對其pH穩定性、熱穩定性和重復使用性進行了探討，發現固定化酶的穩定性在一定程度上都有所提高；Husain等[13]研究了氧化鋅和氧化鋅納米顆粒對半乳糖苷酶的固定化，發現氧化鋅納米顆粒固定的半乳糖苷酶的各種穩定性都優于氧化鋅固定和游離的糖苷酶。目前關于固定化的研究多集中在固定化酶的載體以及固定化酶的穩定性方面，但是對固定化條件的優化研究很少。

本文采用多變量響應面法，對海藻酸鈉-戊二醛交聯法制備固定化FFase進行了工藝優化，獲得了具有更好穩定性和更高重復使用率的固定化FFase。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

海藻酸鈉購自阿拉丁化學品有限公司；戊二醛購自國藥集團化學試劑有限公司。高效液相色譜儀1200購于美國Agilent公司，配ELSD檢測器（300S）購于美國Softa公司；高速冷凍離心機（5418R）購于德國艾本德公司；恒溫磁力攪拌器（JJ-1）購于江蘇中大儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 β-呋喃果糖苷酶游離酶的制備 節桿菌（Arthrobacter sp. 10138）購自中國微生物菌種保存中心，接入種子培養基，在125 r/min，30 ℃條件下震蕩培養24 h，得種子液。然后在裝液量系數0.6，接種量5%（v/v），通氣量2 L/min，轉速200 r/min，pH 6.5，30 ℃下培養48 h，得到發酵液。在4 000 r/min條件下將發酵液離心20 min，取上清保存于-20℃；24 h后解凍再次離心，得到的上清液即為FFase游離酶。

1.2.2 β-呋喃果糖苷酶的海藻酸鈉固定[14]將一定質量的海藻酸鈉緩慢加入溫水中并迅速攪拌，等其溶化均勻后按體積比1∶1與粗酶液混合后靜置片刻。取2.5 mL注射器吸取混合液，緩慢滴入一定濃度的氯化鈣溶液中，固定一段時間后，緩慢攪拌，并過濾。得到的球狀固定化酶用去離子水洗滌，加入戊二醛溶液進行交聯。完成交聯后用去離子水洗滌，即得到FFase固定酶，保存于溫度4 ℃，pH 6.5，滅菌后的緩沖溶液中。

1.2.3 β-呋喃果糖苷酶固定的優化 為篩選出對酶活回收率最重要的因素，運用部分因子設計（FFD）進行優化（表1），評估各因素對酶活回收率的影響及其各因素之間的交互作用。根據單因素實驗結果，選取對固定化結果有較大影響的3個因素，以FFase酶活回收率為響應值進行響應面實驗[15-16]，對固定化條件進行優化。

表1 部分因子設計因素與水平Table 1 The factor and level design of FFD

1.2.4 固定化酶的穩定性實驗 分別對游離酶和固定化酶的貯存、pH、熱穩定性和操作穩定性進行分析。

貯存穩定性：分別將游離酶和固定化酶在相同的緩沖液（pH 6.5）和溫度（4 ℃）下保存18 d。然后每隔3 d取出部分游離酶和固定酶，分別測定其FFase酶活回收率。

pH穩定性：將游離酶和固定化酶分別放置于pH 2-11的緩沖溶液中，30 ℃放置1 h，分別測定游離酶和固定化酶的活力。

熱穩定性：將FFase固定酶放置于pH 6.5的緩沖液中，游離酶調節pH至6.5，兩者分別放40、45、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴1 h后檢測酶活回收率。

操作穩定性：分別將游離酶和固定化酶在pH 6.5、30 ℃下發酵12 h，連續合成低聚乳果糖，連續使用次數10次，測定游離酶和固定化酶酶活回收率。

1.2.5 酶活的定義與酶活回收率 FFase酶活定義：將2 ml的粗酶液和5 ml的糖液（含30%的蔗糖和30%的乳糖，pH 7.0）于37 ℃反應24 h即為低聚乳果糖（lactosucrose，LS）。一個酶活力單位定義為每分鐘在上述條件下產生1×10-9mol LS的量來表示。

式中：y為酶活回收率；EA1為固定前的FFase酶總酶活；EA2為被固定化的FFase酶的總酶活。

2 結果與分析

2.1 部分因子設計篩選固定化條件

影響海藻酸鈉固定化FFase工藝條件包括。采用FFD實驗設計對海藻酸鈉濃度、固定時間、氯化鈣濃度、酶活、戊二醛濃度、交聯時間8個因素進行主因素分析，28-2部分因子設計，包括16個試驗點，并將中心點重復4次作誤差分析，以FFase固定酶酶活回收率為響應值；結果不同條件下酶活回收率在14.31%-59.18%變化。

對實驗結果進行方差分析，模型的P值為0.027，小于0.05，證明模型顯著；相關系數R2=0.943 8，表明數據擬合度較好，94.38%的FFase酶活回收率可以用此模型解釋。由表2可見，海藻酸鈉濃度（P=0.007 6）、固定時間（P=0.002 1）對酶活回收影響非常顯著，交聯溫度（P=0.044 6）對固定化酶的酶活回收率有顯著影響。因此海藻酸鈉濃度、固定時間、交聯溫度為FFase固定化工藝中關鍵因素。

表2 部分因子設計結果Table 2 The parameter estimates of variables of FFD

2.2 單因素實驗

利用不同濃度的海藻酸鈉為載體固定FFase發現：酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的升高而升高，當濃度達到4 g/L時，達到最大值（59%）。隨著濃度的繼續升高，酶活回收率反而下降（圖1）。這說明海藻酸鈉濃度的高低會顯著影響固定酶的活力。這可能是因為：海藻酸鈉與鈣離子反應形成凝膠，使酶固定在凝膠中不易脫落。但是當濃度較低時，形成的凝膠孔徑較大，固定化酶較易流失；而當濃度過高時，凝膠過于致密，孔徑較小，限制了酶、底物和產物的擴散，從而導致了酶活回收率的降低。因此，海藻酸鈉的最適范圍為3-5 g/L。

圖1 海藻酸鈉濃度、固定時間和交聯溫度對固定化效果的影響Fig. 1 Effect of concentration of sodium alginate on the catalytic ability of immobiled FFase

固定時間對酶活回收率影響的結果見圖1所示。當固定時間為60 min時，酶活回收率達到最大值（53%）。固定時間太長或太短都會導致酶活回收率的降低，這是因為固定時間太短，海藻酸鈉鈣凝膠孔徑大，不穩定；而時間太長，鈣離子對FFase固定酶的作用加劇，阻礙底物的反應，從而使酶活回收率降低。因此，固定時間應控制在40-60 min。

當交聯溫度低于20 ℃時，交聯作用不顯著，而高于30 ℃后，酶活回收率急劇降低（圖1）。這是因為戊二醛的交聯性質與其所在環境的pH有關，其交聯性質只有在特定pH下才能充分顯示出來，溫度過高或過低都會導致pH環境的變化，從而使戊二醛的交聯性質降低或喪失。因此，固定化的交聯溫度應在20-30 ℃。

2.3 響應面試驗結果

根據三因素三水平的響應面試驗設計，一共選擇試驗點 15 個，其中12個析因點、3 個零點，測得各試驗點的酶活回收率（Y），方案與結果見表3。根據單因素實驗結果，利用響應面法對固定化條件進一步優化處理。

表3 響應面實驗設計與結果分析Table 3 Response surface design layout and experimental results

在單因素實驗的基礎上，選擇海藻酸鈉濃度（X1）、固定時間（X2）、交聯溫度（X3）3個因素，各取3個水平，以酶活回收率為響應值(Y)，利用SAS 9.2分析軟件進行多元回歸分析與擬合，因素對響應值影響的回歸模型方程如下，

回歸分析見表4，方差分析見表5。由方程可知，因素的主效應順序依次為：固定時間(X2)，海藻酸鈉濃度(X1)與交聯溫度(X3)。

由表4、5的分析結果可以看出：F模型=42.09，P=0.003，則表明模型對于響應值影響顯著，說明了不同固定化條件酶活回收率差異顯著。響應面模型的失擬項表示響應面模型的預測值與實驗的實際值不擬合的概率[17]。而實驗中失擬項P值為0.219，這表明響應面模型的失擬項不顯著。同時模型的R2=0.987 0，說明該模型能夠說明98.7%的響應值的變化，進一步證明了回歸方程對因素水平擬合結果的可靠性。因此，模型選擇合適，可用該回歸方程對固定化酶活回收率進行預測。

2.4 響應面法分析及優化

2.4.1 酶活回收率的分析 根據回歸方程，固定一個因素，分析其他因素對酶活回收率的影響，作出響應面及等高線圖（圖2-4），可直觀地看出各因子對響應值的影響變化趨勢，而且回歸模型存在最大值。再對回歸方程[18]進行方差分析及偏回歸系數估計。

表4 響應面結果回歸分析Table 4 Regression analysis of Response surface design

表5 方差分析Table 5 Variance analysis

圖2 海藻酸鈉濃度、固定時間(X1、X2)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 2 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the sodium alginate concentration and reticulation time

圖3 海藻酸鈉濃度、交聯溫度(X1、X3)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the sodium alginate concentration and crosslinking temperature

圖4 固定時間、交聯溫度(X2、X3)交互作用的曲面和等高線圖Fig. 4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of the reticulation time and crosslinking temperature

從圖2可以看出，當交聯溫度為25 ℃時，海藻酸鈉和固定時間對酶活回收率具有非常顯著的影響。當海藻酸鈉濃度不變時，酶活回收率隨著固定時間的延長而升高；當固定時間不變時，酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高；酶活回收率的變化速率顯示了固定時間的主效應大于海藻酸鈉濃度，與統計結果相符。

從圖3可以看出，當固定時間為60 min時，海藻酸鈉濃度對固定化酶的酶活回收率的影響較交聯溫度更為顯著。當交聯溫度不變時，酶活回收率隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高；當海藻酸鈉濃度不變時，交聯溫度在25 ℃左右，酶活回收率達到最大。酶活回收率的變化速率顯示了海藻酸鈉濃度的主效應大于交聯溫度，與統計結果相符。

從圖4可以看出，當海藻酸鈉濃度為4 g/L時，固定化時間比交聯溫度對固定化酶的影響較為顯著。當交聯溫度不變時，酶活回收率隨著固定時間的延長而升高；當固定時間不變時，交聯溫度在25 ℃左右，酶活回收率達到最大。酶活回收率的變化速率顯示了固定時間的主效應大于交聯溫度，與統計結果相符。

2.4.2 固定化條件的優化 為得到最佳的固定化條件，利用SAS軟件進行嶺脊分析[19]最大值，得到海藻酸鈉濃度X1、固定時間X2、交聯溫度X3的代碼值分別為：0.154 9、0.111 9和0.231 2，酶活回收率理論最大值為60.95%。考慮實際操作的便利性，固定化最佳條件為：海藻酸鈉濃度4 g/L、固定時間為42 min、交聯溫度為26 ℃。

2.4.3 驗證試驗 為了對響應面優化結果進行驗證，在優化的固定化條件下進行3次平行驗證實驗，固定化酶酶活回收率平均值為59.33%，RSD為1.91%，與理論值60.15%非常接近，由此證明模式合理，結果理想。

2.5 固定化酶穩定性研究

將固定化酶和游離酶分別在相同的條件下保存18 d，測定酶活回收率，結果發現：固定化酶與游離酶相比，固定酶的貯存穩定性較好（圖5A）。游離酶在第3 d時，酶活為95.32%，6 d后開始快速下降，12 d時，相對酶活只有9.81%，而固定酶在12 d后相對酶活仍有60%，18 d后還有41.13%。固定化酶的貯存穩定性對實際應用非常重要，如果固定化酶在貯存中出現失活，將會大大降低它的使用價值。

將固定化酶與游離酶分別在相同的pH下放置1 h，結果發現：與游離酶相比，固定化酶具有更好的pH穩定性（pH 4-9），固定化酶的相對酶活都大于70%（圖5B）。pH會改變酶和底物的解離，過酸或過堿都會對酶的活性產生不利影響，甚至使其變性失活，只有在一定pH條件下，酶的活性才能達到最高。在不同pH條件下，游離酶比固定化酶對pH的變化更為敏感，表明FFase固定化后pH穩定性有了顯著提高。

將固定化酶和游離酶在不同溫度下放置相同時間，發現：固定化酶的熱穩定優于游離酶。游離酶高于45 ℃時，酶活回收率急劇下降，70 ℃則基本失活；在60 ℃時，固定酶的相對酶活為79.27%，高于65 ℃時，相對酶活開始快速降低（圖5C）。由此可見，固定化酶的熱穩定性明顯高于游離酶，這可能是由于酶固定化后，凝膠限制了酶分子的整體運動，從而使其使用穩定性增加。固定化酶的熱穩定性對于工業生產具有重要意義。

固定化酶的使用穩定性是其最重要的性能指標，FFase固定酶的使用穩定性即重復再利用性結果如圖6所示。當FFase固定酶連續使用5次，相對酶活回收率在51.71%；使用7次后酶活回收率為16.19%。使用次數越多，固定酶顆粒破碎使酶外泄，相對酶活回收率下降。這是因為FFase包埋在海藻酸鈉鈣凝膠中，FFase不易泄露，增強了其機械強度，從而使固定化酶能重復多次利用，提高其使用穩定性。

圖5 固定化酶與游離酶的貯存、pH和熱穩定性Fig. 5 The storing, pH, thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme

圖6 固定化酶的使用穩定性Fig. 6 Effect of the operate time on FFase immobilized enzyme

3 討 論

與游離酶相比，FFase經海藻酸鈉固定化后，在高溫和極端pH值下具有更好的穩定性，這可能是因為酶結構的固定，限制了酶結構波動的緣故[20]。轉化酶經過木屑固定化后，它在pH 7.6和8.0時具有更好的穩定性，而游離酶在高pH條件下完全失活[21]。固定化酶穩定性的提高對于應用具有重要的意義，比如蔗糖在高溫下更容易溶解，致病菌在高溫下不能生長[22]，此外，酶熱穩定性的提高也限制了生物催化劑在生產中的長期使用[23]。

除了熱穩定性和pH穩定性外，固定化酶的操作穩定性是工業應用中成本效益的關鍵因素[24]。通過將海藻酸鈉固定后的FFase進行多次重復使用，實驗發現固定化酶重復操作5次后相對酶活力仍保持在51.71%，重復7次使用，酶活有16.19%。裴哲等[25]發現采用海藻酸鈉為載體固定化香菇纖維素酶后，固定化酶在重復使用6次后，仍保持72.20%的酶活力。雷生嬌和潘思軼[26]的研究發現以海藻酸鈉為載體，戊二醛為交聯劑的柚皮苷固定化酶重復使用7次后，活力仍保持在60%以上。有研究表明β-葡萄糖苷酶經海藻酸鈉-殼聚糖包埋固定化后，重復使用8次之后其相對酶活力仍大于50%[27]。采用多種載體聯合固定的方式，可能會使固定酶的穩定性更好，因此，我們將會對多種載體聯合固定FFase進行進一步研究。

4 結論

以海藻酸鈉為載體固定化FFase，在單因素實驗的基礎上，運用響應面法對固定條件進行優化，得到FFase固定化的最佳工藝條件為：4 g/L海藻酸鈉，固定42 min，交聯溫度26 ℃，在該條件下，酶活回收率為60.95%。與游離酶相比，固定酶具有更好的貯存穩定性、pH和熱穩定性。其重復操作5次后相對酶活力仍保持在51.71%。

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（責任編輯：王育花）

Optimization of immobilization of β-fructofuranosidase to sodium alginate by response surface methodology

JIANG Bo1,2, MI Shu-mei1,2*, RUAN Zheng1,2, DENG Jin-ping3, HUANG Ya-lin3, YIN Yu-long1,2,4*

（1. College of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330031, China; 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang, Jiangxi 330047, China; 3. Hunan Diyi Biotechnology Co., Ltd, Changsha, Hunan 410148, China; 4. Institute of Subtropical Agriculture, the Chinese Academy of Sciences, Changsha, Hunan 410125, China）

Glycosidases play a vital role in the process of manufacturing functional ingredients. To improve the stability and repetitive usage of glycosidase, many important factors affecting the immobilization of β-fructofuranosidase to sodium alginate were investigated, and the immobilization parameters was optimized by response surface methodology. The crucial factors affecting the immobilization of β-fructofuranosidase contained sodium alginate concentration, immobilization time, and cross-linking temperature. The optimal immobilization conditions were obtained as follows: sodium alginate concentration 4 g/L, immobilization time 42 min, cross-linking temperature 26 ℃, and the recovery of enzyme activity 60.95%. Under the optimal conditions, the residual enzyme activity was more than 60% of the initial enzyme activity after storage for 12 d at 4 ℃. The thermal stability of immobilized FFase was higher than free FFase at 70 ℃. The enzyme activity retained over 51.71% of the initial value after the fifth repeat usage. It showed that the immobilized FFase had the better repetitive utilization.

lactosucrose, fructofuranosidase, enzyme immobilization, sodium alginate, response surface methodology

MI Shu-mei, E-mail: mishumei880912@126.com; YIN Yu-long, E-mail: yinyulong@isa.ac.cn.

Q814.2

A

1000-0275（2016）06-1206-08

10.13872/j.1000-0275.2016.0123

江波, 米書梅, 阮征, 鄧近平, 黃亞霖, 印遇龍. 基于響應面法的海藻酸鈉固定β-呋喃果糖苷酶工藝優化[J]. 農業現代化研究, 2016, 37(6): 1206-1213.

Jiang B, Mi S M, Ruan Z, Deng J P, Huang Y L, Yin Y L. Optimization of immobilization of β-fructofuranosidase to sodium alginate by response surface methodology[J]. Research of Agricultural Modernization, 2016, 37(6): 1206-1213.

江西省科技支撐項目（20132BBF60059）；國家農業科技成果轉化資金項目（2014GB2D200216）。

江波（1987-），男，江西宜春人，碩士，研究方向為食品科學，E-mail：178359961@qq.com；通訊作者：米書梅（1987-），女，山東濟寧人，碩士，研究方向為功能食品，E-mail：mishumei880912@126.com；印遇龍（1956-），男，湖南常德人，博士，研究員，研究方向為動物營養，E-mail：yinyulong@isa.ac.cn。

2015-12-16，接受日期：2016-07-25

Foundation item: Science and Technology Supporting Project of Jiangxi Province (20132BBF60059); National Agricultural Science and Technology Achievements Transformation Projects (2014GB2D200216).

Received 16 December, 2015;Accepted 25 July, 2016