香煙煙霧染毒對雄性大鼠睪丸組織ATP酶活性的影響

張靜，仲春雪，黃云飛，張晨，何麗娟，鄒瑩

香煙煙霧染毒對雄性大鼠睪丸組織ATP酶活性的影響

張靜，仲春雪，黃云飛，張晨△，何麗娟，鄒瑩

目的探討香煙煙霧染毒對大鼠睪丸結(jié)構(gòu)及睪丸組織ATP酶活性的影響。方法清潔級成年雄性SD大鼠70只，隨機分為對照組（10只）和低、中、高劑量染毒組（每組20只，分別給予10支、20支、30支香煙煙霧暴露）。染毒組采用呼吸道靜式染毒，每日1次，每次30 min，各劑量染毒組分別染毒6周和12周（每個時段10只大鼠）。實驗期間記錄各組大鼠體質(zhì)量變化。實驗結(jié)束后，摘取睪丸，HE染色觀察睪丸組織結(jié)構(gòu)，酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測睪丸組織Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性。結(jié)果隨染毒劑量增加，各組大鼠體質(zhì)量逐漸降低（P＜0.05）。染毒組大鼠睪丸病理切片觀察到不同程度損傷，且隨著染毒時間的延長和染毒劑量的增加，損傷逐漸加重。染毒6周后，高劑量組大鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶活性低于其他3組（P＜0.05），Ca2+-ATP酶活性低于對照組（P＜0.05）。染毒12周后，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均較對照組顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論香煙煙霧染毒可減緩雄性大鼠生長，導(dǎo)致睪丸組織損傷，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性降低。

吸煙，煙草；煙霧；大鼠，Sprague-Dawley；睪丸；腺苷三磷酸酶類；鈉鉀交換ATP酶；鈣轉(zhuǎn)運ATP酶類

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國和消費國，吸煙是我國目前面臨的最突出的公共衛(wèi)生問題之一。香煙煙霧是明確的細(xì)胞誘變劑和化學(xué)致癌物，對人體多種組織器官有害，同時也是導(dǎo)致疾病和過早死亡的危險因素［1-2］。研究發(fā)現(xiàn)，長期吸煙對生殖系統(tǒng)會產(chǎn)生不利影響［3-5］。本研究通過建立大鼠香煙煙霧暴露模型，檢測香煙煙霧染毒對雄性大鼠睪丸ATP酶（ATPase）活性的影響，探討其致生殖系統(tǒng)損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑清潔級成年雄性SD大鼠70只，體質(zhì)量180～220 g，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供，動物許可證號：SCXK（新）2011-0001。某品牌過濾嘴香煙，煙氣煙堿量1.2 mg/支，焦油量12 mg/支，新疆卷煙廠生產(chǎn)。超微量Na＋-K＋-ATP酶檢測試劑盒、超微量Ca2＋-ATP酶檢測試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 分組及染毒動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后按隨機數(shù)字表法分為對照組（10只）和低、中、高劑量染毒組（每組20只，分別給予10支、20支、30支香煙煙霧暴露）。染毒組大鼠置于自制染毒箱內(nèi)（80 cm×80 cm×60 cm），采用呼吸道靜式染毒，香煙煙霧由真空泵抽入，每日1次，每次30 min，各劑量染毒組分別染毒6周和12周（每個時段10只大鼠）。對照組大鼠每日相同時間被放置于染毒箱內(nèi)，但未進行染毒。實驗期間觀察動物的生長情況及體質(zhì)量變化。

1.2.2 標(biāo)本采集及處理實驗結(jié)束后腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉動物，摘取雙側(cè)睪丸。右側(cè)睪丸液氮固定，-80℃保存用于制備組織勻漿，左側(cè)睪丸4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），常規(guī)HE染色，光鏡觀察。

1.2.3 睪丸組織勻漿的制備稱取適量睪丸組織，按1∶9（W/V）比例加入生理鹽水，機械勻漿后2 500 r/min離心10 min，所得上清液即為睪丸組織勻漿。生理鹽水10倍稀釋后考馬斯亮藍(lán)法測定各樣品蛋白濃度。

1.2.4 超微量Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP酶活性測定取相同濃度的組織蛋白，按試劑盒操作步驟加樣，混勻，室溫靜置5 min，于636 nm波長處，測定各管吸光度（A）值。按照試劑盒說明計算睪丸組織中Na＋-K＋-ATP和Ca2＋-ATP酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況比較對照組大鼠飲食飲水正常，精神狀態(tài)良好，活動敏捷，體質(zhì)量增加明顯；染毒組大鼠精神狀態(tài)較差，倦怠懶動，出現(xiàn)不同程度飲食飲水量減少，高劑量染毒組大鼠染毒后期出現(xiàn)精神萎靡，進食差。

2.2 各組體質(zhì)量比較經(jīng)過不同染毒劑量及染毒時間后，大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），染毒劑量與染毒時間存在交互效應(yīng)（P＜0.05）。染毒6周后，中、高劑量組大鼠體質(zhì)量較對照組和低劑量組降低（P＜0.05）。染毒12周，隨染毒劑量增加，大鼠體質(zhì)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），各劑量組不同染毒時間體質(zhì)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），這與大鼠處于生長期有關(guān)，見表1。

Tab.1Comparison of body weights of rats between four groups表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（n=10，g，）

Tab.1Comparison of body weights of rats between four groups表1 各組大鼠體質(zhì)量比較（n=10，g，）

＊P＜0.05；F組間=29.090，F(xiàn)時間=274.757，F(xiàn)交互=9.167，均P＜0.05；組間比較：a與對照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量比較，P＜0.05；組內(nèi)比較：A與染毒前比較，B與染毒6周比較，P＜0.05

染毒前238.4±16.2 244.8±17.6 242.2±21.2 243.7±31.7 0.133組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F染毒6周395.9±18.1A 380.0±7.2A 315.0±13.2Aab 281.3±25.1Aab 15.090＊染毒12周451.4±20.1AB 455.3±13.6AB 407.8±13.7ABab 348.3±7.2ABabc 11.649＊F 65.940＊146.043＊67.836＊35.310＊

2.3 大鼠睪丸組織病理變化對照組大鼠睪丸組織曲細(xì)精管形態(tài)規(guī)則，生精上皮基膜完整，各級生精細(xì)胞排列整齊，曲細(xì)精管內(nèi)可見大量精子。染毒12周后，低劑量組大鼠睪丸組織局部界膜剝脫，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞層數(shù)減少。中劑量組大鼠睪丸組織生精細(xì)胞排列疏松紊亂，細(xì)胞間隙明顯。高劑量組大鼠睪丸組織僅見少量的支持細(xì)胞和精原細(xì)胞和精子細(xì)胞，未觀察到游離精子，支持細(xì)胞出現(xiàn)空泡化，見圖1。

2.4 睪丸組織Na+-K+-ATP酶活性變化不同染毒劑量及染毒時間大鼠睪丸組織勻漿中Na+-K+-ATP酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），染毒時間與染毒劑量間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。染毒6周后，高劑量組Na+-K+-ATP酶活性低于其他3組（P＜0.05）；染毒12周后，低、中、高劑量組Na+-K+-ATP酶活性較對照組均明顯降低（P＜0.05），且中、高劑量與低劑量組比較均顯著降低（P＜0.05）。低、中劑量組染毒12周時Na+-K+-ATP酶活性較染毒6周時降低（均P＜0.05）；高劑量組不同染毒時間大鼠睪丸組織勻漿中Na+-K+-ATP酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

2.5 睪丸組織Ca+-ATP酶活性變化經(jīng)過不同劑量染毒后各組Ca2+-ATP酶活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而不同染毒時間后各組Ca2+-ATP酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），暴露時間與暴露劑量間無交互效應(yīng)（P＞0.05）。染毒6周后，高劑量組大鼠Ca2+-ATP酶活性與對照組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；染毒12周后，低、中、高劑量組Ca2+-ATP酶活性較對照組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高、中、低劑量組不同染毒時間大鼠睪丸組織勻漿中Ca2+-ATP酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

Fig.1Rat testis tissue morphology in each group(HE，×400)圖1 各組大鼠睪丸組織形態(tài)（HE，×400）

Tab.2Comparison of Na+-K+-ATP enzyme activity in testes between four groups表2 各組大鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶活性比較（n=10，U/mg，）

Tab.2Comparison of Na+-K+-ATP enzyme activity in testes between four groups表2 各組大鼠睪丸組織Na+-K+-ATP酶活性比較（n=10，U/mg，）

＊P＜0.05；F組間=7.000，F(xiàn)時間=10.827，均P＜0.05，F(xiàn)交互=0.813，P＞0.05；a與對照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，P＜0.05；A與染毒6周比較，P＜0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F 6周1.38±0.18 1.31±0.14 1.22±0.15 0.66±0.16abc3.552＊12周1.38±0.18 0.94±0.10aA0.57±0.11abA0.41±0.12ab8.998＊t 4.612＊12.057＊1.662

Tab.3Comparison of Ca2+-ATP enzyme activity in testes between four groups表3 各組大鼠睪丸組織Ca2+-ATP酶活性比較（n=10，U/mg，）

Tab.3Comparison of Ca2+-ATP enzyme activity in testes between four groups表3 各組大鼠睪丸組織Ca2+-ATP酶活性比較（n=10，U/mg，）

＊P＜0.05；F組間=6.219，P＜0.05；F時間=1.637，F(xiàn)交互=0.104，均P＞0.05；a與對照組比較，P＜0.05

組別對照組低劑量組中劑量組高劑量組F 6周0.81±0.10 0.65±0.11 0.59±0.11 0.47±0.17a 3.601＊12周0.81±0.10 0.42±0.09a 0.44±0.12a 0.31±0.12a 6.281＊t 1.339 0.543 0.592

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠精神狀態(tài)較差，倦怠懶動，出現(xiàn)不同程度飲食飲水量減少，體質(zhì)量增長較緩慢，并且隨著染毒劑量的增加表現(xiàn)更加明顯。各組大鼠的初始體質(zhì)量無顯著差異，染毒12周后隨染毒劑量增加，大鼠體質(zhì)量逐漸降低，提示香煙煙霧染毒會對大鼠生長發(fā)育造成影響。

ATP酶在動物組織內(nèi)廣泛存在，在維持Na+、K+平衡和細(xì)胞內(nèi)外壓方面起重要作用，還可參與氨基酸、糖等物質(zhì)的運輸。睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞及生精細(xì)胞質(zhì)膜和線粒體內(nèi)膜上均有ATP酶存在，其中，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是精子獲能的關(guān)鍵酶，它們介導(dǎo)ATP的降解，為精子纖維收縮提供能量。Na+-K+-ATP酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外Na+、K+濃度，在維持正常細(xì)胞內(nèi)滲透壓及膜電位方面起重要作用；而Ca2+-ATP酶主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣平衡。兩者均參與細(xì)胞內(nèi)外Mg2+、Ca2+、Na+、K+離子轉(zhuǎn)運，以維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整及正常生理生化活動［6-8］。已有研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)自由基增多時，會破壞Na+-K+-ATP酶結(jié)構(gòu)，使Na+-K+-ATP酶活性降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增多，從而激活細(xì)胞膜上的Na+-Ca2+交換，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載，Ca2+-ATP酶活性減弱，最終抑制線粒體氧化磷酸化反應(yīng)，造成ATP合成減少，細(xì)胞能量耗竭［9-10］。

本研究病理結(jié)果顯示，對照組大鼠睪丸組織曲細(xì)精管形態(tài)規(guī)則，各級生精細(xì)胞排列整齊，曲細(xì)精管內(nèi)可見大量精子；而染毒組隨著染毒時間的延長及染毒劑量的增加，睪丸出現(xiàn)不同程度的病理損傷,主要表現(xiàn)為睪丸組織局部界膜剝脫，生精細(xì)胞排列疏松紊亂，精子減少，支持細(xì)胞出現(xiàn)空泡化等。由此可見，香煙煙霧染毒可導(dǎo)致雄性大鼠睪丸組織損傷。

本研究ATP酶活性檢測結(jié)果顯示，染毒6周后，高劑量組大鼠睪丸組織勻漿中Na+-K+-ATP酶活性低于其他3組，Ca2+-ATP酶活性低于對照組。染毒12周后，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織Na+-K+-ATP、Ca2+-ATP酶活性均較對照組顯著降低，并且隨著染毒劑量的增加，降低更加顯著，呈現(xiàn)劑量反應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果均提示香煙中的有害物質(zhì)可導(dǎo)致大鼠睪丸組織中Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，從而抑制線粒體能量代謝功能，最終損害睪丸功能。

綜上所述，香煙煙霧染毒可導(dǎo)致雄性大鼠生長發(fā)育減緩，睪丸組織損傷，Na+-K+-ATP酶及Ca2+-ATP酶活性降低，干擾雄性大鼠睪丸的能量代謝，導(dǎo)致其睪丸能量的產(chǎn)生和利用發(fā)生障礙，從而損害睪丸功能。

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（2016-06-13收稿2016-09-12修回）

（本文編輯胡小寧）

The effect of cigarette smoke exposure on ATPase enzyme activity in testis of male rats

ZHANG Jing,ZHONG Chunxue,HUANG Yunfei,ZHANG Chen△,HE Lijuan,ZOU Ying
Department of Toxicology,College of Public Health,Xinjiang Medical University,Urumqi 830011,China△

ObjectiveTo explore the effect of cigarette smoke exposure on testis structure and ATPase enzyme activity in testis of rats.MethodsSeventy adult male SD rats were randomly divided into the control group(10 rats)and the low,medium,high-dose groups(20 rats in each group,which received the exposure of 10,20,30 sticks of cigarettes respectively).The experimental group was exposed to cigarette smoke for 30 min per day.Each dose group was exposed for six weeks and twelve weeks(10 rats each time).The body weights in each group were recorded during the experiment.At the end of the experiment,testes of rats were removed,and the testicular tissue structure was observed by HE staining.Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme activity of testicular tissue of rats were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsWith the increasing of exposure doses,the body weights of rats decreased(P＜0.05).The microstructure changes of testis were observed in the experimental group,and with the increasing of exposure time and exposure dose,the damage was gradually worse.After 6-week exposure,the Na+-K+-ATPase enzyme activity of testicular tissue was significantly lower in high dose group than that of rest of three groups(P＜0.05),and the Ca2+-ATP enzyme activity was significantly lower than that of the control group(P＜0.05).The activities of Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme in testicular tissue were significantly decreased in the low,medium and high-dose groups than those of control group after being exposed for 12 weeks(P＜0.05).ConclusionCigarette smoke exposure can retard the weight gain,cause the testis tissue damaged and decrease the activities of Na+-K+-ATPase enzyme and Ca2+-ATPase enzyme in testis of male rats.

smoking,tobacco;amog;rats,Sprague-Dawley;testis;adenosine triphosphatases;sodium-potassiumexchanging ATPase;calcium-transporting ATPases

R114

A

10.11958/20160545

國家自然科學(xué)基金資助項目（81260433）；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目（2014211C015）

烏魯木齊,新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室（郵編830011）

張靜（1979），女，副教授，博士，主要從事生殖發(fā)育毒理方向研究

△通訊作者E-mail:zhangchendr@163.com