布倫登盧普沙門菌耐藥性與毒力基因分析

趙展，夏琳林，劉曉霞，楊杰，吳曉妹，張利娟，賈宇馳，王玉寶

布倫登盧普沙門菌耐藥性與毒力基因分析

趙展，夏琳林，劉曉霞，楊杰，吳曉妹，張利娟，賈宇馳，王玉寶△

目的研究臨床分離的非傷寒沙門菌布倫登盧普血清型（布倫登盧普沙門菌）對抗菌藥物的耐藥性及其攜帶的毒力基因特征。方法收集2012—2014年每年4—10月天津市兩家教學醫院腸道門診急性腹瀉患者的臨床資料，將急性腹瀉患者糞便標本進行沙門菌分離培養、生化及PCR鑒定、血清學分型，對得到的布倫登盧普沙門菌進行抗菌藥物敏感性檢測、PCR擴增沙門菌毒力島（SPI）1～5的代表性基因和SPI的調節基因。結果3年共檢測到非重復非傷寒沙門菌153株，其中8株（5.23%）為布倫登盧普沙門菌。8株invA-PCR鑒定均呈陽性，對萘啶酸耐藥率100%，對環丙沙星和左氧氟沙星中介耐藥率100%，對其余檢測的抗菌藥物敏感；8株均檢測到了SPI 1～5代表性基因和SPI調節基因（sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB和phoP）。結論天津地區布倫登盧普沙門菌臨床株對氟喹諾酮耐藥并攜帶SPI 1～5毒力基因與調節基因，對公眾健康構成潛在威脅，應持續開展相關監測與研究。

腹瀉；抗藥性，微生物；喹諾酮類；氟喹諾酮；毒力；布倫登盧普沙門菌

在各種食源性病原體中，非傷寒沙門菌（Nontyphoidal Salmonella，NTS）造成的公共健康問題非常突出，在全球每年約導致9 380萬人患急性胃腸炎和15.5萬人死亡［1］。沙門菌毒力島（Salmonella Pathogenicity Islands，SPI）是沙門菌染色體上的大片段DNA，可攜帶多種毒力基因，幫助其侵入人體并在免疫細胞中存活和復制，與傷寒或NTS的致病能力密切相關［2］。NTS包括近3 000種血清型，引起感染和暴發最常見的血清型是腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌［3］。布倫登盧普沙門菌（S.Braenderup）在NTS中的分離比例雖然不高，但該血清型的大規模暴發感染在國內外均有報道［4-5］。國外已發現S.Braenderup對氟喹諾酮和三代頭孢等抗菌藥物的耐藥株，但國內鮮見S.Braenderup對抗菌藥物耐藥性及攜帶毒力基因的研究報道。本研究對2012—2014年每年4—10月連續3年臨床分離的S.Braenderup進行了相關分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2012—2014年每年4—10月就診于天津醫科大學第二醫院和天津醫科大學總醫院腸道門診急性腹瀉患者的臨床資料。3年共153例NTS感染，其中8例為S.Braenderup；5例來自天津醫科大學第二醫院，3例來自天津醫科大學總醫院；包括男5例、女3例，年齡25～62歲，中位年齡（P25，P75）為40.50（28.75，60.75）歲。

1.2 主要試劑與儀器細菌生化鑒定試紙條API20E（法國梅里埃公司），沙門菌血清診斷試劑盒（丹麥國立血清研究所），氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、頭孢他啶、阿米卡星、鏈霉素、四環素、萘啶酸、環丙沙星、左氧氟沙星、復方磺胺甲和氯霉素等抗菌藥物標準品或藥敏紙片（北京天壇藥物生物技術開發公司），厄他培南藥敏紙片（上海賽默飛世爾科技有限公司），PCR儀（Mastercycler personal，德國eppendorf公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌株的分離、培養及生化鑒定按照《食品衛生檢驗方法微生物學部分》GB/4789-2010中腸道致病菌檢驗方法對患者糞便標本進行分離培養和菌株生化鑒定。

1.3.2 菌株的PCR鑒定煮沸法提取細菌DNA，以沙門菌屬特異性基因invA為靶基因進行PCR擴增。引物序列和PCR反應條件參照文獻［6］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（下同）。PCR陰性質控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽性質控菌株腸炎沙門菌1311均為本研究所保存。

1.3.3 菌株的血清學鑒定按照沙門菌血清診斷試劑盒說明書步驟操作，根據診斷血清與菌株O抗原、H抗原和Vi抗原的凝集反應結果比對Kauffmann-White抗原表確定沙門菌屬的血清型［7］。S.Braenderup的抗原式為6,7,14:e,h:e,n,z15。

1.3.4 抗菌藥物敏感性試驗按照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2014年提供的方法［8］，采用K-B紙片法和微量肉湯稀釋法檢測菌株對13種抗菌藥物的敏感性。結果判讀參照CLSI 2014年抗微生物藥物敏感性試驗執行標準，以大腸桿菌ATCC25922為質控菌株。

1.3.5 菌株毒力基因檢測PCR擴增檢測S.Braenderup SPI 1～5代表性基因sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB及調節基因phoP。PCR陰性質控菌株大腸埃希菌ATCC25922和陽性質控菌株腸炎沙門菌1311同1.3.2。煮沸法提取菌株DNA模板，引物和PCR反應條件參照文獻［9］，引物序列及目的片段長度見表1。

2 結果

2.1 S.Braenderup的分離率2012—2014年自我市兩所教學醫院腸道門診共分離出8株（5.23%）S.Braenderup，每年均有檢出。該8株菌經PCR鑒定，均能擴增出符合預期大小（283 bp）的invA基因片段，見圖1。

Tab.1Primer sequences of virulence genes表1 毒力基因引物序列

Fig.1Electrophoresis results of PCR products of invA genes圖1 invA基因PCR產物電泳結果

2.2 S.Braenderup藥敏結果該8株菌對萘啶酸耐藥率100%，對環丙沙星和左氧氟沙星中介耐藥率100%，對氨芐西林、阿莫西林/克拉維酸鉀、頭孢曲松、頭孢他啶、厄他培南、阿米卡星、鏈霉素、四環素、復方磺胺甲、氯霉素等抗菌藥物均敏感。

2.3 S.Braenderup毒力基因PCR擴增結果8株菌SPI代表性基因經PCR擴增均能得到符合預期大小的DNA片段，部分菌株PCR電泳結果見圖2。

Fig.2Electrophoresis results of PCR products of representative virulence genes of SPI 1-5圖2 SPI 1～5代表性毒力基因PCR產物電泳結果

3 討論

3.1 S.Braenderup的臨床分離率S.Braenderup屬于NTS血清學分型中的C1群，因1937年在丹麥的布倫登盧普地區第1次被發現而得名，目前國內外從人及動物中均有分離出該沙門菌血清型的報道。S.Braenderup在不同國家和地區的流行程度不同。瑞士1989—1992年間NTS感染病例中僅有0.5%由S.Braenderup所致［10］；而馬來西亞北部對分離自患者的NTS研究中S.Braenderup所占比例高達11.25%［11］。我國福建省2006—2011年臨床患者采集到449株沙門菌，包括381株NTS，其中有2株為S.Braenderup（0.52%）［12］。本研究3年間共分離到S.Braenderup 8株（5.23%），高于福建省，說明S.Braenderup感染在本地區并非少見。

3.3 臨床株攜帶毒力基因的特征目前已經鑒定出23種SPI，研究比較深入的是SPI 1～5，而phoP與phoQ基因一起構成一個二元系統，可調節SPI在沙門菌中的表達。本研究對S.Braenderup SPI 1～5的各自代表性基因和phoP基因進行PCR擴增均得到陽性結果。提示這些臨床分離的S.Braenderup均攜帶SPI 1～5和SPI調節基因，因而具有很強的致病能力。食品來源的NTS攜帶SPI的情形與本研究中臨床分離的NTS有所不同。研究發現，市售鮮雞蛋中NTS攜帶SPI 1～5中的一類或多類，只有部分菌株具有SPI-1+SPI-2+SPI-3+SPI-4+SPI-5的組合，與菌株的強致病性顯著相關［15］。國外研究顯示，分離自患者糞便和血液標本的NTS攜帶的SPI種類并無明顯差別，這提示能引起人類胃腸炎的NTS均有導致血液感染的潛在能力［16］。

3.4 感染暴發的識別與監測S.Braenderup在瑞士、日本等國家均造成過大規模感染暴發［4,10］。在我國引起的數十至上百例的集體食物中毒也時有發生［5］。本研究中的8例患者雖然分散在2012—2014年，但是菌株的藥敏譜完全一致，提示病例之間可能具有流行病學關聯。由公共衛生部門主導的以菌株基因分型為基礎的監測體系，例如國際食源性疾病分子分型網絡PulseNet，可以幫助早期識別NTS感染暴發。2014年，美國疾病預防控制中心（CDC）通過PulseNet發現了6例S.Braenderup感染，雖然該6例分散在5個州、時間跨越4個月，但菌株PFGE基因分型完全一致，經過詳細的流行病學調查后，最終確認這是一起感染暴發，感染源是一家食品加工廠制作的被S.Braenderup污染的杏仁和花生醬，之后立即采取相應措施及時避免了更多病例的出現［17］。目前，我國北京、上海、浙江等省市已加入了PulseNet China系統，為維護公眾健康，天津市很有必要加入該監測系統。

綜上所述，自2012—2014年本地區持續分離到對喹諾酮耐藥并攜帶SPI 1～5毒力基因與調節基因的S.Braenderup，其對公眾健康構成一定威脅。為有利于指導臨床合理使用抗菌藥物，早期識別并有效控制感染暴發，天津地區應長期開展NTS的耐藥監測，并建立以分子分型為基礎的食源性病原體監測體系和溯源體系。

致謝：感謝中國疾病預防控制中心腹瀉病研究室和天津醫科大學總醫院感染性疾病科對本研究提供的大力支持和幫助。

［1］Majowicz SE，Musto J，Scallan E，et al.The global burden of nontyphoidalSalmonellagastroenteritis［J］.ClincalInfectious Diseases，2010，50（6）:882-889.doi:10.1086/650733/j.issn.1537-6591.

［2］Xue Y，Guo RX，Qian SS，et al.Research progress on Salmonella pathogenicity islands［J］.Journal of Microbes and Infections，2015，10（6）:381-389.［薛穎，郭榮顯，錢珊珊，等.沙門菌毒力島的研究進展［J］.微生物與感染，2015，10（6）:381-389］.

［3］Ge HY，Wu XM，Wang Y，et al.Outbreak of Salmonella enterica serotypeenteritidisinfectionsandgenotyping［J］.ChinJ Nosocomiol，2013，23（20）:4865-4867.［戈紅雨，吳曉妹，王悅，等.腸炎沙門菌感染暴發的病原學檢測及基因分型研究［J］.中華醫院感染學雜志，2013，23（20）:4865-4867］.

［4］Mizoguchi Y，Suzuki E，Tsuchida H，et al.Outbreak of Salmonella Braenderup infection originating in boxed lunches in Japan in 2008［J］.Acta Med Okayama，2011，65（2）:63-69.

［5］Zheng YZ，Zhou YP，Yang CX，et al.An investigations on S. Braenderup food poisoning［J］.Lit&Inf Prev Med，1999，5（1）:14-17.［鄭玉柱，周亞平，楊春秀，等.一起布倫登盧普沙門氏菌食物中毒調查［J］.預防醫學文獻信息，1999，5（1）:14-17］.doi: 10.16406/j.pmt.issn.1672-9153.1999.01.008.

［6］Huan J，Ge HY，Zhang CL，et al.Establishment of double PCR method for detection of Salmonella and Proteus［J］.Journal of Tianjin Medical University，2015，21（1）:84-86.［郇娟，戈紅雨，張成龍，等.雙重PCR檢測沙門氏菌和變形桿菌方法的建立［J］.天津醫科大學學報，2015，21（1）:84-86］.

［7］Shi W，Xia LL，Liu XX，et al.Antimicrobial resistance and mechanismsofceftriaxoneresistanceinclinicallyisolated nontyphoidal Salmonella［J］.Chin J Infect Control，2016，15（4）: 217-221.［師偉，夏琳林，劉曉霞，等.臨床分離非傷寒沙門菌耐藥性及對頭孢曲松耐藥機制［J］.中國感染控制雜志，2016，15（4）:217-221］.doi:10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.001.

［8］Clinical and Laboratory Standards Institute.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing，twenty-three in formational supplement［S］.CLSI document Ml00-S24.2014.

［9］Zhang CL.Virulence-associated genes of Non-typhoidal Salmonella isolated from patients with diarrhea［D］.Tianjin：Tianjin Medical University，2015.［張成龍.非傷寒沙門氏菌臨床株毒力基因初步分析［D］.天津：天津醫科大學，2015］.

［10］Urfer E，Rossier P，Mean F，et al.Outbreak of Salmonella braenderup gastroenteritis due to contaminated meat pies:clinical and molecular epidemiology［J］.Clin Microbiol Infect，2000，6（10）:536-542.

［11］Thong KL，Lai WL，Dhanoa A，et al.Antimicrobial susceptibility and pulsed:field Gel Electrophoretic analysis of Salmonella in a tertiary hospital in northern Malaysia［J］.Infect Public Health，2011，4（2）:65-72.doi:10.1016/j.jiph.2011.03.003.

［12］Chen JH，Ou JM，Yang JS，et al.Analysis on the distribution of serotypes and drug resistance with salmonalla strains，fujian province，2006-2011［J］.Prev Med Trib，2014，20（2）:81-87.［陳建輝，歐劍鳴，楊勁松，等.2006—2011年福建省沙門菌監測菌株血清型分布及耐藥性分析［J］.預防醫學論壇，2014，20（2）: 81-87］.doi:10.16406/j.pmt.issn.1672-9153.2014.02.014.

［13］Aarestrup FM，Wiuff C，Molbak K，et al.Is it time to change fluoroquinolone breakpoints for Salmonella spp?［J］.Antimicrob Agents Chemother，2003，47（2）:827-829.

［14］Lin D，Chen K，Wai-Chi Chan E，et al.Increasing prevalence of ciprofloxacin-resistant food-borne Salmonella strains harboring multiple PMQR elements but not target gene mutations［J］.Sci Rep，2015，5:14754.doi:10.1038/srep14754.

［15］Wang JY，Dong R，Wang LQ，et al.Isolation，identification and pathogenicity island gene detection of Salmonella in commercial eggs［J］.Food Science，2012，33（16）:154-158.［王晶鈺，董睿，王利勤，等.市售鮮雞蛋中沙門氏菌的分離鑒定及毒力島基因檢測［J］.食品科學，2012，33（16）:154-158］.

［16］Suez J，Porwollik S，Dagan A，et al.Virulence gene profiling and pathogenicitycharacterizationofnon-typhoidalSalmonella accounted for invasive disease in humans［J］.PLoS One，2013，8（3）:e58449.doi:10.1371/journal.pone.0058449.

［17］CDC.Multistate Outbreak of Salmonella Braenderup Infections Linked to Nut Butter Manufactured by nSpired Natural Foods［EB/ OL］.（2014-10-16)［2016-9-26］.Inc.http://www.cdc.gov/ salmonella/braenderup-08-14.

（2016-07-08收稿2016-09-29修回）

（本文編輯李鵬）

Antimicrobial resistance and virulence gene profiling of Salmonella enterica serovars Braenderup

ZHAO Zhan,XIA Linlin,LIU Xiaoxia,YANG Jie,WU Xiaomei,ZHANG Lijuan,JIA Yuchi,WANG Yubao△
Institute of Infectious Diseases,Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China△

ObjectiveTo investigate antimicrobial resistance and virulence gene profiles of clinically isolated nontyphoidal Salmonella enterica serovars Braenderup(S.Braenderup).MethodsClinical date of patients with acute diarrhea from two teaching hospitals in our city were collected from April to October of 2012 to 2014.Salmonella from stool samples was screened by culture,and identified by biochemical,PCR and serotype methods.Isolates of S.Braenderup were examined with antibiotic susceptibilities.PCR amplification was used for representative genes of Salmonella pathogenicity islands (SPI)1-5 and SPI regulator.ResultsAmong 153 non-repetitive NTS isolates in the three years,8 isolates(5.23%)of S.Breanderup were identified.All 8 isolates were positive with invA gene.The resistance rate to nalidixic acid was 100%, and the same with the intermediate resistance rate to ciprofloxacin and levofloxacin.But they were susceptible to other antimicrobial agents.The 8 isolates were positive with the representative genes of SPI 1-5 and regulators(sitC,hilA,sseL, sifA,mgtC,siiE,sopB and phoP).ConclusionClinical isolates of S.Braenderup in Tianjin are resistant to fluoroquinolones and harbored genes of SPI 1-5 and regulator,and which can threaten public health.Continuous surveillance and research should be carried out in our city.

diarrhea;drug resistance,microbial;quinolones;fluoroquinolones;virulence;Salmonella Breanderup

R378.22

A

10.11958/20160630

天津市衛生局科研基金資助項目（2013KZ112）

天津醫科大學第二醫院感染性疾病研究所（郵編300211）

趙展（1992），女，碩士在讀，主要從事細菌耐藥及致病機制研究

△通訊作者E-mail：wyb2046@163.com