頭孢噻肟鈉、轉鐵蛋白相互作用的光譜特征

崔萌萌， 劉保生， 李彤彤， 段韶彤

(河北大學化學與環境科學學院 河北省分析科學技術重點實驗室， 河北 保定 071002)

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頭孢噻肟鈉、轉鐵蛋白相互作用的光譜特征

崔萌萌， 劉保生*， 李彤彤， 段韶彤

(河北大學化學與環境科學學院 河北省分析科學技術重點實驗室， 河北 保定 071002)

將轉鐵蛋白(TRF)的熒光變化作為研究對象，在298，310，318 K下采用紫外吸收、傳統熒光、同步熒光、圓二色譜法，對TRF與頭孢噻肟鈉(CEM)的結合進行綜合分析。數據處理和分析結果顯示：TRF的熒光伴隨CEM濃度的提高而呈現規律性猝滅，猝滅方式是靜態的。兩者借助靜電作用結合，反應生成新物質。結果的準確性通過上述方法進行了驗證。此外，同步熒光和圓二色譜也表明CEM影響了TRF的構象。

作用機制； 轉鐵蛋白； 光譜法； 頭孢噻肟鈉

1 引 言

轉鐵蛋白(Transferrin, TRF)是血漿蛋白質的一類，相對分子量約為80 ku(kDa)，包含679個氨基酸殘基，這些氨基酸殘基排列在一對相似的結構域，即N端和C端[1]。TRF受體能夠在許多癌細胞表面過度表達，因此TRF作為藥物載體能夠運輸多種配體，如金屬離子和藥物分子[2]。TRF的介導作用可促進藥物進入病變細胞，防止對未病變細胞的損傷，增強藥物的靶向性，因此TRF常用于研究藥物在機體的代謝和運輸過程[3]。白蛋白(SA)的研究較多，SA可用于判斷機體的營養情況且能快速體現營養檢測效果，然而SA在機體的半衰期較長，靈敏度差；TRF于肝處合成，半衰期不長，判斷營養狀況時TRF靈敏度高，故研究TRF具有醫學意義[4]。

頭孢噻肟鈉(Cefotaxime sodium,CEM)可用于治療大腦、皮膚、骨骼、胃、呼吸道、耳朵和尿路等的多種感染[5]。CEM是第三代頭孢類抗生菌素。早期的頭孢菌素不能滲透進中樞神經系統，無法成功治療腦膜炎；然而第三代頭孢菌素能夠進入中樞神經系統，因此可以用于治療革蘭氏陰性菌引發的腦膜炎[6]。目前TRF的相關分析不多，沒有報道過與CEM的結合。本文借助傳統熒光猝滅、紫外吸收、同步熒光以及圓二色譜法來分析TRF、CEM間的作用機制，為以后相關的臨床用藥以及藥理作用帶來有價值的理論根據。

2 實 驗

2.1 儀器與試劑

儀器：RF-540熒光分光光度計和UV-265紫外可見分光光度計(島津公司)；MOS-450/SFM300圓二色譜儀(法國Bio-logic)；pHS-3C型精密酸度計(上海雷磁)；CS501超級恒溫水浴(南通科學)。

試劑：TRF(Sigma公司)，純度≥98%，配成濃度為1.0×10-5mol/L的水溶液。CEM，純度≥98.5%，配成1.0×10-3mol/L的水溶液。Tris-HCl緩沖溶液，pH=7.40，含有0.15 mol/L的NaCl用以維持生理條件下的離子強度。除標注外的試劑均是分析純。實驗用水為二次石英蒸餾水。溶液均在4 ℃下避光保存。

熒光強度值按“內濾光效應”方程[7]校正：

(1)

其中，Fcor和Fobs是校正后和測得的TRF-CEM體系熒光強度，Aex和Aem是CEM在激發和發射波長處的吸光度。

2.2 實驗過程

在多個5 mL比色管中順序加入0.5 mL Tris-HCl緩沖溶液、0.5 mL 2.0×10-6mol/L的TRF以及不同濃度的CEM溶液，定容、搖勻、水浴恒溫在298 K下靜置40 min。激發波長(λex)為280 nm或295 nm，設置5 nm的狹縫寬度，掃描TRF-CEM體系的熒光光譜。固定波長差Δλ=15 nm以及Δλ=60 nm，記錄TRF-CEM體系的同步熒光光譜。溫度分別設置在310 K和318 K下重復上述實驗。使用1 mm的石英吸收池，測定200～300 nm波長范圍內TRF與CEM作用前后的CD譜。在一系列5 mL比色管中加入0.5 mL Tris-HCl緩沖溶液、1.0 mL TRF(1.0×10-5mol/L)溶液及不同濃度的CEM溶液，用二次蒸餾水定容，靜置40 min待反應完全。以對應濃度的藥物溶液作參比，掃描各體系在190～350 nm的紫外光譜。

3 結果與討論

3.1 TRF-CEM體系的傳統熒光光譜及猝滅機理

圖1為CEM的分子結構式，圖2為TRF-CEM體系的熒光發射光譜。

圖1 頭孢噻肟鈉的結構式

Fig.1 Chemical structure of CEM

CTRF=2.0×10-7mol/L； 1～10:CCEM= (0, 0.02, 0.4, 0.8, 2.0, 5.0, 8.0, 10, 12, 14)×10-5mol/L .

圖2 TRF-CEM體系的熒光發射光譜 (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.2 Fluorescence emission spectra of TRF-CEM system (T=298 K,λex=280 nm)

隨著CEM溶液的加入以及濃度的增大，TRF的熒光逐漸發生猝滅，說明兩者發生了相互結合[8]。實驗數據借助斯特恩-沃爾默方程處理[9]：

(2)

方程中F0、F是TRF、TRF-CEM體系的熒光強度，τ0是分子熒光平均壽命(約10-8s)，KSV是猝滅常數，[L]是CEM的濃度，Kq是猝滅速率常數。數據處理結果見表1。表1顯示，溫度升高則KSV變小，Kq值大于2.0×1010L·mol-1·s-1[10]，說明TRF的熒光猝滅主要是生成化合物而導致的靜態猝滅[11]。

表1 不同溫度下TRF與CEM的猝滅反應參數

r1為方程F0/F～[L]的線性相關系數；r2為lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}的線性相關系數。

以F0/F對[L]作圖(圖3)，圖中顯示隨著CEM濃度的增大，3條斯特恩-沃爾默曲線均未偏向縱軸，呈現良好的線性關系，表明不存在動態猝滅。若CEM濃度高時逐漸出現動態猝滅，則表現為曲線漸偏向縱軸[12]。同時，從298 K到310 K再到318 K，曲線斜率逐漸變小，即KSV變小，與表1所顯示的數據規律相吻合。

針對靜態猝滅，處理數據采用方程[13]：

lg(F0/F-1)=

(3)

可得到Ka(結合常數)和n(結合位點數)。方程中[L]、[Bt]各是CEM、TRF的總濃度。n值設為1，以lg(F0-F)/F～lg{[L]-n[Bt](F0-F)/F0}作圖可得大括號外的n值，代入括號內繼續作圖又可得到一個n值，再將得到的n代入括號內，如此循環計算至括號內外兩n值相同。得到的數據列于表1，從表中可得n值近似于1，說明結合位點只有一個。溫度降低則Ka值增大說明相互作用生成的復合物的穩定性隨溫度降低而增大，進而證明TRF-CEM反應過程主要為靜態猝滅[14]。

CTRF=2.0×10-7mol/L；CCEM=(2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 12, 14)×10-5mol·L .

圖3 不同溫度下TRF-CEM體系的斯特恩-沃爾默曲線 (λex=280 nm)

Fig.3 Stern-Volmer plots of TRF-CEM system at different temperatures (λex=280 nm)

3.2 TRF-CEM體系的吸收光譜以及結合距離的分析

圖4為TRF-CEM體系的吸收光譜。從圖4可知，CEM溶液濃度增大則TRF吸光度降低，峰位置紅移。該現象表明TRF-CEM體系產生了新的化合物[15]。動態猝滅過程僅改變熒光分子的激發態而不會干擾其吸收譜圖，故CEM對TRF的猝滅是靜態猝滅[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L； 1～6：CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 8.0, 10)×10-5mol/L .

圖4 TRF-CEM體系紫外吸收光譜圖 (T=298 K)
Fig.4 UV absorption spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

依照福斯特能量轉移理論，TRF和CEM之間距離r、能量轉移效率E、臨界能量轉移距離R0(對應E=50%)三者的計算方程[17]為：

(4)

(5)

(6)

其中F0、F分別表示不加CEM、CEM濃度均為2×10-7mol/L時體系的熒光強度；Φ表示僅有TRF的熒光量子產率，取TRF中Trp (Tryptophan 色氨酸) 的量子產率0.118；N表示溶劑的折射率，取1.336；J是TRF的發射光譜與CEM的吸收光譜之間的重疊積分(圖5中陰影部分)；K2表示取向因子，取TRF和CEM各向隨機分布的平均值2/3；ε(λ)、F(λ)各表示λ處CEM的摩爾吸光系數和TRF的熒光強度。摩爾吸光系數和熒光強度值可借助圖5兩縱坐標相互換算。在圖5陰影部分曲線1、2交點左側時，ε(λ)、F(λ)分別取曲線2對應的摩爾吸光系數和熒光強度值；在交點右側時，ε(λ)、F(λ)分別取曲線1對應的摩爾吸光系數和熒光強度值。將所取值代入方程(6) 中即可得J。借助上述3個方程，E、J、R0、r均可得到，列于表2。表2顯示：r<7 nm，證明TRF、CEM兩者間存在非輻射能量轉移[18]；溫度降低時，E增大，r減小，TRF與CEM生成的化合物的穩定性增大；r>R0，再次證明CEM、TRF間的反應是靜態猝滅過程[16]。

圖5 CEM的紫外吸收光譜(1) 和TRF的熒光發射光譜(2) (T=298 K,λex=280 nm)

Fig.5 UV absorption spectra of CEM (1) and fluorescence emission spectra of TRF (2) (T=298 K,λex=280 nm)

表2 不同溫度下TRF與CEM間的E、J、r、R0參數

Tab.2 Parameters ofE,J,r,R0between TRF and CEM at different temper atures (λex=280 nm)

T/KE/%J/(cm3·L·mol-1)R0/nmr/nm2987.295.29×10-143.244.943105.495.77×10-143.285.273185.185.28×10-143.235.25

3.3 TRF-CEM體系的作用力分析

借助CEM和TRF相互結合的熱力學參數，可判斷TRF和CEM的作用力類型。ΔG、ΔS、ΔH間的關系方程[19]為：

(7)

(8)

利用方程(7)、(8)計算熱力學參數，列于表3。表中ΔG<0、ΔS>0證明TRF和CEM的反應是熵變大、自由能變小的自發反應。ΔH<0、ΔS>0證明TRF與CEM作用力類型主要是靜電引力[19]。

表3 不同溫度下TRF-CEM體系的熱力學參數(λex=280,295 nm)

3.4 TRF-CEM體系的同步熒光光譜

關于TRF的同步熒光譜圖，Δλ=15 nm時體現酪氨酸(Tyr)殘基的熒光變化，Δλ=60 nm時體現色氨酸(Trp)殘基的熒光變化[20]。TRF-CEM體系的同步熒光光譜見圖6。Δλ=15 nm時，熒光發生輕微猝滅和紅移；Δλ=60 nm時，熒光發生明顯猝滅和紅移。該現象說明只有少量的Tyr參加反應，而參加反應的主要是Trp。峰位置移動說明TRF、CEM的相互作用致使Trp和Tyr所在微環境的極性變大，疏水性減小，肽鏈變得松散，進而改變了TRF的構象[20]。

CTRF=2.0×10-7mol/L; 1～10:CCEM= (0, 0.4, 2.0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0, 9.0, 10, 14)×10-5mol/L .

圖6 TRF-CEM體系的同步熒光光譜 (T=298 K)。 (a) Δλ=15 nm; (b)Δλ=60 nm。

Fig.6 Fluorescence spectra of TRF-CEM system (T=298 K). (a) Δλ=15 nm. (b)Δλ=60 nm.

3.5 藥物協同性

TRF和CEM結合的協同性可借助Hill方程[21]中的nH來進行分析：

(9)

其中，nH代表Hill系數，K代表結合常數，Y代表反應飽和分數。

(10)

熒光數據處理時：

(11)

其中，1/Qm是1/Q～1/[L]作圖所得的截距。將TRF-CEM體系的熒光強度值F代入方程，逐步計算得到相應的Hill系數值，如表4所示。在不同溫度下，λex=280 nm和295 nm時nH都近似于1，說明CEM、 TRF的相互作用不會促進也不會抑制后繼配體與TRF的作用，即表現為無協同作用[14]。

表4 不同溫度下TRF-CEM體系的Hill系數nH(λex=280,295 nm)

Tab.4 Hill coefficient of TRF-CEM systems at different temperatures(λex=280, 295 nm)

T/Kλex=280nmλex=295nmnHr3nHr42981.050.99800.960.99363101.010.98681.020.98553181.030.98511.020.9922

r3、r4為方程lg[Y/(1-Y)]～lg[L]的線性相關系數。

3.6 TRF-CEM體系的圓二色譜分析

圓二色譜(CD)可用以顯示蛋白質構象變化。圖7是TRF-CEM結合的CD圖。211 nm與219 nm附近各存在一個特征峰，為α螺旋的特征峰。CCEM∶CTRF分別為20∶1、30∶1時，負峰高度降低，其位置與形狀均無變化，由此顯示：α螺旋變松進而致使TRF熒光猝滅，CEM的存在改變了TRF的構象，然而α螺旋依然是其主要結構形式[16]。

CTRF=2.0×10-6mol/L;CCEM=(4.0, 6.0) ×10-5mol/L .

圖7 TRF-CEM體系的圓二色譜圖

Fig.7 Circular dichroism spectra of TRF-CEM system (T=298 K)

4 結 論

在TRF和CEM的結合中，r<7 nm，表明該過程存在非輻射能量轉移。CD圖顯示CEM影響了TRF的二級結構，致使熒光強度降低，兩者的反應對后繼配體的反應不存在促進或抑制的作用。TRF與CEM的結合常數Ka顯示兩者能相互結合。熱力學參數顯示TRF、CEM的作用依靠靜電引力。CEM能被TRF運輸，借助血液循環到達作用部位。本研究能對理解藥物在機體的分布、轉運過程和作用機理提供幫助，對抗感染藥物的特定篩選提供參考。

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崔萌萌(1989-),女，山東東營人，碩士研究生，2013年于濟寧學院獲得學士學位，主要從事分子發光學理論與應用的研究。

E-mail: 1286023098@qq.com劉保生(1963-)，男，河北保定人，碩士，研究員，1992年于河北大學獲得碩士學位，主要從事分子發光學理論與應用的研究。

E-mail: lbs@hbu.edu.cn

Spectral Properties of The Interaction Between Transferrin and Cefotaxime Sodium

CUI Meng-meng, LIU Bao-sheng*, LI Tong-tong, DUAN Shao-tong

(KeyLaboratoryofAnalyticalScienceandTechnologyofHebeiProvince,CollegeofChemistry&EnvironmentalScience,HebeiUniversity,Baoding071002,China)

The interaction between transferrin (TRF) and cefotaxime sodium (CEM) at different temperatures (298, 310 and 318 K) was studied by using UV absorption spectroscopy, traditional fluorescence spectroscopy, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy. The experiment results indicate that the fluorescence of TRF is regularly quenched with the addition of CEM. The quenching pattern is static. TRF and CEM are combined by electrostatic interaction, and new compound forms during the process. These different methods verify the accuracy and rationality of the results. In addition, synchronous fluorescence spectroscopy and circular dichroism spectroscopy both show the conformation of TRF is influenced by CEM.

interaction mechanism; transferrin; spectroscopy; cefotaxime sodium

1000-7032(2016)11-1415-07

2016-05-10；

2016-06-17

國家自然科學基金(21375032)資助項目

O657.3

A

10.3788/fgxb20163711.1415

*CorrespondingAuthor,E-mail:lbs@hbu.edu.cn