何首烏提取物對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的影響

唐 靜，曾雅莉，何 婷

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何首烏提取物對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠的影響

唐 靜1，曾雅莉1，何 婷2*

目的 研究何首烏不同提取物對2型糖尿病胰島素抵抗大鼠血糖、胰島素抵抗及InsR基因表達的影響。方法 高脂飼料喂養聯合腹腔內注射小劑量四氧嘧啶制造糖尿病胰島素抵抗大鼠模型，分別用二甲雙胍、何首烏水提物、何首烏乙醇提取物、何首烏正丁醇提取物進行干預，觀察給藥前后大鼠空腹血糖、血清胰島素水平，計算胰島素抵抗指數(HOMA-IR)及胰島素敏感指數(ISI)，采用RT-PCR法測定肝細胞膜InsR mRNA基因表達情況。結果 三組何首烏提取物的血糖、FINS、HOMA-IR水平較模型組顯著下降(P<0.01)，ISI水平顯著上升(P<0.01)；肝細胞膜上InsR基因表達量上升。結論 何首烏提取物改善2型糖尿病大鼠的胰島素抵抗，可能與上調InsR基因表達量有關。

何首烏提取物；糖尿??；血糖；胰島素抵抗；InsR

0 引言

胰島素抵抗是影響2型糖尿病進程和發展的主要病理因素之一[1]。胰島素受體(Insulin receptor,InsR)基因分布較廣，如脂肪、肝臟、骨骼肌等。胰島素發揮其功能必須以InsR為介導，細胞InsR數目減少,胰島素與胰島素受體結合能力減低[2-3]，可引起血糖升高。何首烏是蓼科蓼族何首烏PolygonummultiflorumThumb.的干燥塊根，具有解毒(截瘧)、消癰、潤腸通便的功效[4]。陳俊等[5]研究顯示，制何首烏可以降低糖尿病大鼠的血糖，抑制胰島細胞凋亡。

本實驗通過高脂飼料喂養聯合腹腔內注射小劑量四氧嘧啶的方法，建立大鼠的糖尿病胰島素抵抗模型，分別用二甲雙胍、何首烏水提物、何首烏乙醇提取物、何首烏正丁醇提取物進行干預，觀察給藥前后大鼠空腹血糖、血清胰島素水平，計算HOMA-IR、ISI，并從InsR基因表達角度探討何首烏提取物改善胰島素抵抗的機制，為何首烏進一步的研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥材 何首烏生藥(湖北天濟中藥飲片有限公司)；二甲雙胍片(中美上海施貴寶制藥有限公司)；葡萄糖(GLu)購自南京建成生物工程研究所；75%乙醇為中國醫藥(集團)上海化學試劑公司產品，Trizol試劑購自nvitrogen公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自Fermentas公司，Ex TaqTM、DL2000 DNA Marker購自TAKARA公司。

1.2 儀器 血糖儀one touch(強生中國)，R-205型旋轉蒸發儀(瑞士BuChi公司)，ADVIA2400型全自動生化分析儀(德國西門子)，EDC-810型PCR儀(東勝創新生物科技有限公司)。

1.3 動物 SD大鼠SPF級，雌雄各半[武漢大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號：SCXK(鄂)2014-0004]，高脂飼料(配方:10%豬油、10%蔗糖、5%蛋黃粉、1%膽固醇、74%常規飼料)。

1.4 何首烏提取物的制備 取何首烏生藥5 kg，洗凈、陰干、切片，用蒸餾水加熱回流提取3次，每次回流時間2 h，合并提取液，經減壓濃縮至干，得何首烏水提物，臨用前稀釋至一定濃度(10 g/kg)后備用。再取5 kg藥材，按文獻[6]方法提取，濃縮至0.5 mL/g后，向其中加入95%乙醇至溶液中含醇量為70%，虹吸上清液，沉淀減壓抽濾后得何首烏醇提物，稀釋至一定濃度(10 g/kg)后備用；將上清液加入正丁醇萃取，回收，至干，稀釋至一定濃度(10 g/kg)后，得何首烏正丁醇提取物，備用。

1.5 大鼠糖尿病模型的建立及分組 取健康SD大鼠，適應性喂養3 d，除正常組外，其余組高脂喂養，4周后，于腹腔注射現配四氧嘧啶溶液，于30 s內注射完，連續注射2 d[7](第1天劑量為120 mg/kg，第2天劑量為100 mg/kg)，末次注射后第3天測定血糖情況(隨機血糖≥11.1 mmol/L作為糖尿病模型成功的標志[8])。造模成功后，將大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、何首烏水提組、何首烏醇提組、何首烏正丁醇組。除正常組飼以基礎飼料外,其余組給予高脂飼料喂養，正常組與模型組給予等體積的生理鹽水，連續灌胃喂養6周。于末次給藥后禁食12 h，用10%水合氯醛麻醉大鼠后，取血測定FPG、FINS，計算ISI、HOMA-IR。ISI=IN[1/(FPG×FINS)]，HOMA-IR=(FRG×FINS)/22.5]，處死后，留取肝臟組織進行相關研究。

1.6 RT-PCR檢測mRNA Trizol法提取RNA后，逆轉錄成cDNA，設計Real-time PCR引物(表1)，采用RT-PCR法，檢測各組大鼠肝臟內InsR的表達。應用2-ΔΔCt方法對InsR mRNA的表達水平進行定量分析，即處理組基因表達水平相對于正常組的變化倍數為2-ΔΔCt倍[9]，最終數據以2-ΔΔCt進行分析(表1)。

表1 PCR引物序列表

2 結果

2.1 何首烏提取物對大鼠血糖的影響 給藥0周時，與正常組相比，其余各組大鼠血糖、胰島素水平增加明顯，表明其已發生糖尿病胰島素抵抗。給藥6周后，與模型組相比，陽性對照組和何首烏提取物各組血糖均出現下降，且差異均有統計學差異(P<0.01)；三組何首烏提取物之間的降糖療效比較，差異無統計學意義(P>0.05)。這說明三組何首烏提取物療效相近，均可在一定程度上降低糖尿病大鼠血糖水平。見表2、表3。

2.2 何首烏提取物對大鼠FINS、HOMA-IR、ISI的影響 連續給藥6周后，陽性對照組、三組何首烏提取物組2型糖尿病胰島素抵抗大鼠FINS、HOMA-IR水平較模型組顯著下降(P<0.01)、ISI水平顯著上升(P<0.01)；且何首烏醇提物組與陽性對照組在控制FINS、HOMA-IR、ISI水平上比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明其改善胰島素抵抗的療效與二甲雙胍相當，而水提、正丁醇提取物在改善胰島素抵抗方面與二甲雙胍有一定的差異。見表3、表4。

表2 何首烏提取物對血糖的影響(mmol/L)

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

表3 何首烏提取物對胰島素的影響(mIU/L)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05

2.3 何首烏提取物對InsR基因表達的影響 不同組別擴增出來的內參β-actin表達一致，說明整個實驗體系正常(圖1)。在給藥6周后，與正常組相比，模型組InsR基因表達出現明顯下調(P<0.05)，陽性對照組及何首烏各給藥組與模型組相比均能使大鼠的InsR mRNA表達出現顯著上調，但差異無統計學意義(圖2、圖3)。

表4 何首烏提取物對HOMA-IR、ISI的影響

注：與正常組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01；與陽性對照組比較，△P<0.05

圖1 RT-PCR β-actin表達圖

注：1.DL2000,2.正常組,3.模型組,4.陽性對照組,5.何首烏水提組,6.何首烏醇提組,7.何首烏正丁醇組

圖2 RT-PCR InsR表達圖

注：1.DL2000,2.正常組,3.模型組,4.陽性對照組,5.何首烏水提組,6.何首烏醇提組,7.何首烏正丁醇組

圖3 何首烏提取物對大鼠肝細胞膜InsR mRNA相對表達的影響

注：與正常組比較，*P<0.05

3 討論

我國2013年糖尿病的患病人數為9 840萬，居全球首位，預計到2035年我國的糖尿病患病人數將達到1.43億。胰島素抵抗是2型糖尿病發病的主要原因之一[10]。在正常機體組織中，細胞膜上的胰島素受體與胰島素結合非常敏感。由于肥胖等原因造成細胞膜上的胰島素受體功能下降或者數量減少，使胰島素不能與受體正常結合，導致胰島素不能發揮應有的作用，就會發生胰島素抵抗[11]。

本研究以高脂高糖飼料喂養大鼠引起大鼠高脂血癥、高胰島素血癥。采用四氧嘧啶腹腔注射造模，因一次性大劑量腹腔注射造模方法成活率較低[7]，改為兩次給藥造模。造模后，模型組大鼠FPG、FINS、HOMA-IR升高，ISI降低，說明2型糖尿病胰島素抵抗大鼠模型造模成功。

李奇等[12]采用水提法、醇提法等7種方法制備的何首烏提取物均含有二苯乙烯苷類、沒食子酸類、蘆薈大黃素類、大黃酸類、大黃素類化合物，只是含量不同。本實驗通過3種不同提取工藝，證實何首烏提取物均能有效降低糖尿病大鼠的血糖水平，且能改善胰島素抵抗。

InsR是一種跨膜的大分子糖蛋白[13]，是胰島素信號轉導的起始部位，其表達水平直接影響胰島素的生物學效應[14]。本研究發現，在糖尿病胰島素抵抗的大鼠模型中，血糖升高，InsR基因表達水平明顯降低(P<0.05)，在給予何首烏提取物治療后，血糖水平逐漸下降，InsR基因表達量上調，且三組何首烏提取物在增強InsR基因表達量上差異無統計學意義(P>0.05)。陳紹文等[15]發現，采用何首烏生品大鼠灌胃后，何首烏中有相當數量成分在大鼠體內快速代謝或者反應。結合本實驗的研究結果，提示何首烏中可能存在某類成分或代謝產物，能改善胰島素抵抗，且有效成分在三組提取物中均存在，可能只是含量存在差異，且以何首烏醇提物組內成分含最較高，這類物質或代謝產物均能通過上調靶組織內InsR基因表達水平，改善該組織對胰島素的敏感程度，降低血糖。

綜上所述，我們初步認為，何首烏提取物通過上調糖尿病大鼠肝臟組織InsR基因表達水平，促進葡萄糖的攝取與利用，降低血糖，提示何首烏提取物在改善胰島素抵抗方面可能會有一定的療效。但其改善胰島素抵抗的機制仍需進一步探討。

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Effect of polygonum multiflorum extract on insulin-resistant rats with type 2 diabetes

TANG Jing1，ZENG Ya-li1，HE Ting2*

(1.Liyuan Hospital Affiliated to Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430077,China；2.The No.3 Hospital of Wuhan,Wuhan 430060,China)

Objective To study the effects of different extracts from polygonum multiflorum on glucose,insulin-resistance and InsR gene expression in rats with insulin-resistant diabetes.Methods The diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of a small dose of alloxan and were fed with high-fat diet.The rats were divided into different groups and were given metformin,water extract,ethanol extract,n-butyl alcohol extract from polygonum multiflorum.The glucose and fasting insulin (FINS) was measured before and after administration,and the homeostasis model assessment-insulin resistance (HOMA-IR) index and insulin sensitive index(ISI) were calculated.The expression levels of insulin receptor (InsR) mRNA were detected by PCR.Results Compared with control group,three different extracts from polygonum multiflorum reduced the glucose,FINS and HOMA-IR (P<0.01),elevated the ISI (P<0.01),and increased the expression of InsR.Conclusion Three different extracts from polygonum multiflorum obviously improve the insulin resistance by increasing the expression of InsR mRNA.

Polygonum multiflorum extract；Diabetes；Blood glucose；Insulin resistance；InsR

2016-05-19

1.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院,武漢 430077；2.武漢市第三醫院藥劑科,武漢 430060

華中科技大學自主創新基金(2014QN072)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611004

*通信作者