S1P4受體通過Akt調節骨髓瘤細胞凋亡的機制研究

楊融輝,石小巖,傅 迪,仲 媛,鄭金科,廖愛軍

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S1P4受體通過Akt調節骨髓瘤細胞凋亡的機制研究

楊融輝,石小巖,傅 迪,仲 媛,鄭金科,廖愛軍*

目的 探討S1P受體對多發性骨髓瘤(MM)細胞系LP-1生存及凋亡的影響及調控機制。方法 應用芬戈莫德(FTY720)抑制LP-1細胞S1P受體，CCK-8法測定細胞生存率，流式細胞儀檢測凋亡率。應用qRT-PCR方法檢測LP-1細胞中S1P受體的表達情況。應用 S1P4R-shRNA敲除S1P4受體，采用熒光顯微鏡及qRT-PCR法測定病毒感染率及感染后S1P4受體表達。Western blot方法檢測S1P4受體敲除后抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表達情況。結果 FTY720處理后，LP-1細胞生存率明顯下降，凋亡率明顯上升，與對照組相比差異均具有統計學意義(P<0.05)。LP-1細胞中S1P4受體呈高表達，敲除S1P4受體后，抗凋亡蛋白Akt、Survivin、Birc4、Bag-1表達明顯下降(P<0.05)。結論 S1P受體對LP-1細胞生存具有重要作用。其中S1P4受體在LP-1細胞凋亡中起主要作用。S1P4受體可通過Akt調節下游抗凋亡蛋白Survivin、Birc4、Bag-1的表達，從而影響LP-1細胞凋亡。

S1P4受體;多發性骨髓瘤；Akt；凋亡

0 引言

多發性骨髓瘤(MM)是漿細胞異常增殖的惡性腫瘤，隨著治療藥物的逐漸增多，MM療效較前明顯改善，但目前仍無法治愈[1-2]。筆者前期研究證實，1-磷酸鞘氨醇(S1P)受體抑制劑芬戈莫德(FTY720)可誘導MM細胞系U266產生凋亡及自噬[3]，而 Pi3k/Akt/mTOR通路對細胞凋亡及自噬均具有調節作用，已成為MM靶向藥物研究的熱點之一。本研究旨在探討S1P受體(S1PRs)對多發性骨髓瘤LP-1細胞系生存及凋亡的影響，并探討S1PRs對Pi3k/Akt/mTOR通路的調控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 LP-1細胞系(我院血液內科凍存)，慢病毒S1P4R-shRNA及LV-NC(上海吉瑪公司)，RPMI 1640培養基(Thermo公司)，標準胎牛血清(Thermo公司)，DMSO(Sigma公司)，CCK-8試劑盒(Dojindo公司)，RNA提取試劑盒(全式金公司)，逆轉錄試劑盒(全式金公司)，PCR試劑盒(全式金公司)，PCR引物(大連寶生公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、增殖率及凋亡率檢測 實驗選用人多發性骨髓瘤LP-1細胞系，細胞復蘇后置入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，于37 ℃+5% CO2環境孵箱中培養。取對數期細胞進行CCK-8檢測，細胞接種于96孔板，調整細胞密度為2.5×104/mL，每孔90 μL，實驗組加入FTY720，調整終濃度為10.0 μmol/L，對照組加入等量含LP-1細胞的RPMI 1640培養基，空白組加入等量不含細胞的培養基。37 ℃+5% CO2環境孵箱中培養24 h后加入CCK-8試劑10 μL，繼續孵育4 h，酶標儀檢測450 nm處吸光度值(OD值)，計算細胞的生存率，生存率(%)=(OD實驗組-OD對照組) /(OD空白組-OD對照組)×100%。每組實驗重復3次，取平均值。另取實驗組及空白組細胞，調整密度1×106/mL接種，孵箱培養24 h后收集細胞，按照流式凋亡試劑盒處理細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.2 PCR檢測 PCR法檢測LP-1細胞系S1PRs表達水平差異。提取細胞總RNA并合成cDNA，實驗步驟依據試劑盒要求進行；然后以cDNA為模板，GAPDH為內參，用S1PRs引物進行PCR擴增，引物序列見表1。

表1 引物序列

設定反應條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，63 ℃ 30 s，40個循環后記錄循環閾值(Ct值)。采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達量。實驗重復3次，取Ct平均值進行分析。

1.2.3 S1P4受體敲除 收集對數期細胞接種于6孔板，調整細胞密度為1×106/mL，實驗組加入S1P4R-shRNA慢病毒 25 μL/孔+Polybrene 10 μL/孔，對照組加入等量陰性對照(LV-NC)及Polybrene，置于孵箱培養，熒光顯微鏡每24 h觀察一次細胞GFP表達情況，結合熒光蛋白表達粗估轉染效率。72 h后采用PCR法檢測細胞系S1P4受體是否敲除。

1.2.4 Western blot方法 收集轉染S1P4R-shRNA和LV-NC病毒及未經處理過的 LP-1細胞，提取細胞總蛋白，按2.5×106/mL的細胞密度轉移至離心管，1 500 r/min離心5 min，仔細吸凈上清。加入RIPA裂解液200 μL，充分裂解后，14 000 r/min離心5 min，取上清于-80 ℃凍存。BCA法測定蛋白濃度，計算蛋白上樣量并上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后轉移到PVDF膜上，BSA封閉2 h后，加入Survivin、Bag-1、Birc4、Akt、GAPDH單克隆抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜，TBST液洗膜3次，5 min/次，然后加入HRP標記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，再次洗膜3次，5 min/次，ECL發光液顯影，用image-J 軟件分析灰度值。

2 結果

2.1 FTY720對LP-1細胞生存及凋亡的影響 CCK-8結果顯示，FTY720處理后，細胞生存率明顯降低(圖1A)，凋亡率明顯增高(圖1B)，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

圖1 FTY720對LP-1細胞生存及凋亡的影響

2.2 LP-1細胞S1PRs表達情況 LP-1細胞系中S1P4受體相較于其他受體呈高表達。見圖2。

圖2 LP-1細胞S1PRs表達情況

2.3 S1P4受體敲除結果 熒光顯微鏡觀察顯示，無論S1P4R-shRNA還是LV-NC組，細胞內均呈高熒光狀態，表明慢病毒質粒均進入細胞內(圖3A)。qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，S1P4受體敲除達74%(圖3B)。

2.4 S1P4R敲除后抗凋亡蛋白表達情況 Western bolt 結果顯示，與正常細胞及空質粒相比，敲除S1P4受體后，細胞內Akt、Survivin、Bag-1、Birc4表達明顯減低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 S1P4受體敲除情況

3 討論

S1P是一種鞘脂類化合物，已被證實對腫瘤細胞生長、代謝、血管生成、死亡等進程具有重要調節作用。S1P的生物學功能是通過與其受體S1PRs相結合實現的[4]。S1PRs分為5種(S1PR1～5)，各受體亞型能偶聯不同G蛋白偶聯受體，調節下游信號，實現對生物學功能的調節[5]。FTY720是S1P類似物，實際上起到S1PRs抑制劑的作用，能有效抑制各S1P受體亞型活性[6]。本研究結果顯示，經FTY720處理后，LP-1細胞生存率明顯降低，凋亡率明顯提高，表明S1PRs受體對多發性骨髓瘤LP-1細胞生長生存及凋亡具有重要作用。

Pi3k/Akt/mTOR通路是影響細胞凋亡調控的經典通路之一，其中Akt是通路中的重要蛋白，除通過下游mTOR調節Bcl-2等抗凋亡因子活性外，Akt還能通過激活下游NF-κB通路、磷酸化p53結合蛋白、抑制caspase 9的活性等，直接或間接調節Survivin、Birc4、Bag-1等凋亡相關因子，阻止凋亡級聯反應的啟動和進行[7-8]。在LP-1細胞系中，S1P4受體呈高表達狀態，推測S1P4受體是調節LP-1細胞系生長生存的主要受體亞型。敲除S1P4受體后，Akt表達明顯降低，說明S1P4受體可通過Pi3k/Akt/mTOR通路調節下游信號。

圖4 S1P4受體敲除后抗凋亡蛋白表達情況

Survivin、Birc4、Bag-1均是活性較強的凋亡抑制因子，已被證實參與多發性骨髓瘤、黑色素瘤、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤發生、發展等多個進程[9-10]。其中Survivin和Birc4均能作用于caspase酶，Survivin能直接或通過caspase 9間接抑制caspase 3和caspase 7活性抑制細胞凋亡[ 11-12]，Birc4在抑制caspase 3和caspase 7活性之外，還能通過結合TNF-α受體相關因子TRAF1和TRAF2抑制細胞凋亡[13 ]。而Bag-1可與Hsp70/Hsc70、Raf-1及蛋白酶體等形成復合體，參與細胞周期調控、應激反應及蛋白修飾等，并通過Bcl-2等多種途徑抑制細胞凋亡[14]。本研究中，敲除S1P4受體后，Survivin、Birc4、Bag-1表達均明顯下降，推測S1P4受體可通過Akt途徑調節下游抗凋亡蛋白，從而抑制細胞凋亡。

S1P4受體對多發性骨髓瘤LP-1細胞系生存及凋亡具有重要調控意義，抑制S1P4受體可下調Akt、Survivin、Birc4、Bag-1等抗凋亡蛋白水平，促進LP-1細胞凋亡，S1P4受體可能是多發性骨髓瘤治療的潛在靶點。本實驗為前期實驗，對于S1P4受體如何影響多發性骨髓瘤細胞凋亡的深入研究仍需進一步進行。

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Mechanism of S1P4 receptor in regulating apoptosis of myeloma cells via Akt

YANG Rong-hui,SHI Xiao-yan,FU Di,ZHONG Yuan,ZHENG Jin-ke, LIAO Ai-jun*

(Department of Hematology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To explore the effect of S1P receptor on the survival and apoptosis of LP-1 cell line of MM and its mechanism.Methods Fingolimod (FTY720) was used to inhibit S1P receptor of LP-1 cell line;CCK-8 assay was performed to evaluate cell viability and flow cytometry was performed to detect the apoptosis rate.The expression of S1P receptors was measured by qRT-PCR.S1P4R-shRNA was used to knock down S1P4 receptor,then the expression of S1P4 was measured by fluorescence microscope and qRT-PCR assay.The expression of antiapoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin in S1P4 silented cell was detected by Western blot.Results The LP-1 cell survival rate decreased significantly after FTY720 treatment,and the apoptosis rate was also significantly increased (P<0.05).S1P4 receptor expression in LP-1 cell line was the highest,while the expression of anti-apoptotic protein Akt,Bag-1,Birc4 and Survivin decreased obviously after the S1P4 receptor was knocked down (P<0.05).Conclusion S1P receptors play an important role in the survival of LP-1 cells,while S1P4 receptor plays a major role in the apoptosis of LP-1 cells.S1P4 receptor can regulate the expression of antiapoptotic protein Bag-1,Birc4 and Survivin via Akt,and affect the apoptosis of LP-1 cells

S1P4;Multiple myeloma;Akt;Apoptosi;

2016-07-28

中國醫科大學附屬盛京醫院血液內科,沈陽 110004

國家自然科學基金 (81272629)

10.14053/j.cnki.ppcr.201611002

*通信作者