血紅素加氧酶-1在糖尿病心肌病中的保護作用※

司立寧，劉慧琴，王曉麗，王 財，莊正燕，甘桂芬

(青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001)

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血紅素加氧酶-1在糖尿病心肌病中的保護作用※

司立寧，劉慧琴，王曉麗，王 財，莊正燕，甘桂芬*

(青海大學附屬醫院，青海 西寧 810001)

目的 觀察血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)的保護作用并探討其相關分子機制。方法 對出生8 w的雄性HO-1轉基因小鼠和同籠陰性小鼠連續5次腹腔注射STZ(50mg/kg)，以血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型入選標準，常規飼養8 w，期間每周檢測小鼠血糖、飲水量、進食量、尿量和體重，小鼠取材前利用超聲心動圖檢測小鼠左室心臟功能。斷頸處死小鼠后取左室心肌并進行電鏡和病理組織學檢查；用qRT-PCR法檢測心肌ANP、BNP mRNA表達情況。并對相關數據作統計學分析。結果 超聲心動圖檢查發現，與對照組小鼠相比糖尿病組小鼠均存在心臟功能障礙，過表達HO-1的糖尿病小鼠左室心臟功能明顯好于糖尿病小鼠；HE染色和透射電鏡結果顯示糖尿病小鼠心肌結構紊亂，線粒體損傷明顯；過表達HO-1糖尿病小鼠心肌結構和線粒體結構紊亂情況改善。相對于對照組小鼠，糖尿病小鼠心肌中ANP和BNP mRNA表達升高，過表達HO-1糖尿病小鼠心肌中ANP和BNP mRNA表達降低。結論 HO-1可改善由糖尿病引起的心臟功能障礙和心肌結構損傷。

糖尿病心肌病 血紅素加氧酶-1 保護作用

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)與糖尿病患者心血管疾病的高發生率和高病死率密切相關[1]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)作為一種公認的心肌保護因子，可通過其產物的抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用發揮對心臟的保護功能[2]。但有關HO-1在糖尿病心肌病中的作用認識存在相互矛盾的現象。本研究利用過表達HO-1的轉基因小鼠，通過腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導糖尿病心肌病模型，觀察HO-1對STZ誘導的糖尿病心肌病的保護作用并探討其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器選擇

雄性SPF級Tg-HO-1轉基因小鼠和同籠陰性小鼠各30只，購自STZ購自Sigma公司。Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、Real-time PCR試劑盒均購自Invitrogen公司；7500型號Real-time PCR儀購自ABI公司；血糖儀和血糖試紙條購自Roche公司；IE33型號心臟超聲儀購自PHILIPS公司。

1.2 實驗分組與動物模型制作

將動物按體重隨機分為4組，對照組(Wt/Con，n=15)、過表達HO-1對照組(HO-1/Con，n=15)、糖尿病組(Wt/DM，n=15)、過表達HO-1糖尿病組(HO-1/DM，n=15)。

STZ溶解在pH為4.5的枸櫞酸鹽緩沖液中，使用前臨時配制，連續5次腹腔注射STZ(50mg/kg)誘導糖尿病模型，對照組腹腔注射檸檬酸鹽緩沖液，72 h后取尾靜脈血測隨機血糖，以血糖≥16.7 mmol/L作為糖尿病模型入選標準。所有動物自由飲水，喂養8 w后進行實驗。實驗過程中出現少量動物死亡。

1.3 血糖、體重、飲水量、進食量和尿量測定

各組小鼠每周測定隨機尾靜脈血糖1次；每周測定小鼠體重1次；每周利用代謝籠測定各組小鼠飲水量、進水量和尿量1次。

1.4 心功能評價

各實驗組小鼠以2%異氟烷吸入麻醉，仰臥位固定于37 ℃恒溫加熱板上，左胸前區脫毛，采用14 MHz的高頻心臟超聲探頭置于小鼠左側胸前，2D超聲示左室短軸切面，在乳頭肌水平應用M模式超聲記錄左心室情況，取3個心動周期的平均值記錄數據。超聲學檢測指標：左室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volum，LVEDV)，左室收縮末期容積(left ventricular end systolic volum，LVESV)，射血分數(left ventricular ejection fraetion，LVEF)。

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1.5 心肌形態學觀察

透射電鏡檢測：快速切取大小為0.5～1.0 mm3的樣品，1 min內把組織塊浸入2.5%戊二醛溶液固定。送檢蘭州大學電鏡中心。HE染色：沿小鼠心臟左心室縱切，取適量心肌組織，加10倍量4%多聚甲醛固定，脫水后用石蠟包埋，切片(厚度4μm)，行常規HE染色，鏡下觀察：細胞核深藍色，胞漿及纖維組織呈深淺不等的紅色。

1.6 心肌內ANP和BNP mRAN水平檢測

采用Trizol試劑提取各組小鼠心肌組織總RNA。取總RNA 2 μg，逆轉錄合成第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板，PCR擴增ANP和BNP，內對照為GAPDH。引物設計如下：

ANP sense，5′-CACGCCAGCATGGGCTCCTT-3′；

ANP antisense，5′-CTAAGTGCCGCCCCCGCTTC-3′；

BNP sense，5′-GACGGGCTGAGGTTGTTTTA-3′；

BNP antisense，5′-ACTGTGGCAAGTTTGTGCTG-3′；

GAPDH sense，5′-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3′；

GAPDH antisense，5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3′。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠血糖、進食量、飲水量、尿量、體重及心重/體重的變化(表1)

糖尿病小鼠建模成功后8 w，每周檢測小鼠的血糖、進食量、飲水量、尿量和體重，結果顯示與Wt/Con組相比，Wt/DM組小鼠血糖、進食量、飲水量和尿量均明顯升高(P<0.01)，體重明顯降低(P<0.01)，糖尿病小鼠出現“三多一少”的表型，與臨床糖尿病患者體征相似；與Wt/Con組相比，Wt/DM組小鼠心臟重量明顯減少(P<0.01)，心重/體重比值明顯升高(P<0.01)。與Wt/DM組相比。HO-1/DM組小鼠血糖(P<0.05)、尿量(P<0.01)和心重/體重比值(P<0.01)明顯降低，飲食量(P<0.05)和體重(P<0.01)明顯升高，飲水量和心臟重量無顯著差異。

Table 1 Basic parameters of mice in each ±s)

與Wt/Con組比較，#P<0.05，##：P<0.01；與Wt /DM 組比較，*P<0.05，**P<0.01.

2.2 各組小鼠左心室功能變化(表2)

臨床研究發現，長期糖尿病患者會伴隨左心室舒張和收縮功能障礙。腹腔注射STZ 8 w后，利用多普勒超聲儀檢測小鼠左心室功能。表2結果顯示與Wt/Con組相比，Wt/DM組小鼠LVESV(P<0.01)和LVEDV升高(P<0.05)，LVEF降低(P<0.01)。與Wt/DM組相比，HO-1/DM組小鼠LVESV降低(P<0.01)，LVEF升高(P<0.01)，但LVEDV差異不顯著。由此可見，過表達HO-1可以保護糖尿病小鼠心臟功能障礙。

Table 2 Left Ventricular Function of the mice in each ±s)

與Wt/Con組比較，#P<0.05，##：P<0.01；與Wt /DM 組比較，*P<0.05.

2.3 各組小鼠左心室HE染色及電鏡變化(圖1)

糖尿病小鼠左室心肌HE染色：與Wt/Con組或HO-1/Con組相比，Wt/DM組小鼠左室心肌HE染色發現明顯的肌纖維紊亂，并有炎癥細胞浸潤；與Wt/DM組相比，HO-1/DM組小鼠左室心肌肌纖維排列較整齊。電鏡：Wt/DM組小鼠肌纖維溶解、斷裂，并且線粒體出現腫脹，但HO-1/DM組小鼠左室心肌肌纖維排列較整齊，線粒體結構基本正常。該結果提示過表達HO-1可能能改善糖尿病引起的心肌結構損傷。

a、b、c、d：將小鼠左心室肌組織的石蠟切片進行HE染色，觀察心肌的形態學(20μm)；e、f、g、h：將小鼠左心室肌組織行透射電鏡檢測，觀察心肌超微結構(5μm)

圖1 各組小鼠心肌結構圖

Figure 1 Cardiac Morphology and electron micrographs of mice in each group

2.4 各組小鼠心肌中ANP和BNP的表達(表3)

ANP和BNP是反映心臟功能的兩個重要指標。Wt/Con組和HO-1/Con組之間小鼠心肌ANP和BNP mRNA 表達無顯著差異；與Wt/Con組相比，Wt/DM組小鼠心肌ANP和BNP mRNA表達升高(P<0.01)；過表達HO-1后這種升高明顯被抑制(P<0.01)。該結果與超聲和形態學結果一致，進一步驗證了HO-1在糖尿病心肌病中發揮著保護心臟功能的作用。

Table 3 The Cardiac ANP and BNP mRNA expression in each group of ±s)

與Wt/Con組比較，#P<0.01；與Wt /DM組比較，*P<0.01.

3 討論

本研究通過利用過表達HO-1的轉基因小鼠證實：HO-1在STZ誘導的糖尿病心肌病小鼠模型中具有保護左室心肌結構和心臟功能的作用。

臨床上將排除冠狀動脈疾病或高血壓病之外的由糖尿病引起的左室功能障礙和結構異常的疾病稱為糖尿病心肌病。臨床證據顯示糖尿病心肌病患者心臟功能障礙早期主要表現為以舒張功能降低為主的心功能減弱，心臟多普勒超聲技術檢查糖尿病心肌病早期患者時發現，LVEDV升高，同時早期左室充盈下降，患者舒張期延遲；晚期的糖尿病心肌病患者心臟超聲結果顯示，LVESV升高，同時LVEF降低[3]。本研究采用連續5次腹腔注射STZ(50mg/kg)誘導造模，在注射后8 w心臟功能明顯受損，小鼠心臟超聲結果顯示，LVESV、LVEDV均升高，LVEF降低，并且心肌中ANP和BNP mRNA表達明顯升高，發現心肌結構紊亂和線粒體損傷。

HO-1在很多心血管疾病中發揮重要的保護作用。DiFilippo對STZ誘導的大鼠的心肌梗死面積與HO-1的表達進行相關研究，發現使用HO-1的拮抗劑抑制HO-1表達造成梗死面積的進一步增加[4]。有研究表明，糖尿病心肌病大鼠模型中氧化應激可誘導HO-1表達增加，認為HO-1對慢性高血糖誘發的氧化性損傷具有保護作用。Turkseven等也發現糖尿病大鼠中HO-1表達增加，并且伴隨超氧化物歧化酶和過氧化氫酶表達增加，以此有效清除細胞基質中的超氧陰離子[5]。劉璐等研究發現，上調HO-1可抑制氧化應激反應，恢復eNOS/iNOS平衡，提高內皮功能和胰島素敏感性，達到改善心肌功能和冠脈灌注效果的目的[6]。但是，Hana研究發現高血糖可通過誘導HO-1表達增加和活性提高，增加心肌中的氧化應激損傷[7]。本研究發現過表達HO-1可以降低LVESV和升高LVEF，降低心肌中ANP和BNP mRNA的表達，改善糖尿病心肌病小鼠左室心臟功能，并且過表達HO-1可保護心肌結構紊亂和線粒體損傷。因此，我們設想HO-1在糖尿病心肌病中可能具有”雙刃劍”作用，該作用可能與其活性閾值相關。

HO-1是體內一種有效的抗氧化應激的酶系統，是防治糖尿病心肌病發生發展的重要心臟保護因子。但本研究仍需進一步闡明HO-1保護糖尿病心肌病的具體機制。

[1]Hamby RI，Zoneraich S，Sherman L.Diabetic cardiomyopathy[J].JAMA，1974，229：1749-1754.

[2]Wu ML，Ho YC，Yet SF.A central role of heme oxygenase-1 in cardiovascular protection[J].Antioxid Redox Signal，2011，15(7)：1835-1846.

[3]Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy：evaluation by Doppler echocardiography[J].J Am CollCardiol，2006，48：1548-1551.

[4]DiFilippo C，Marfella R，Cuzzocrea S，et al.Hyprglycemia in streptozotocin-induced diabetic rat increases in farctsize associated with low levels of myocardial HO-1 during ischemia/reperfusion[J].Diabetes，2005，54(3)：803-810.

[5]TurksevenS，KrugerA，MingoneCJ，et al.Theantioxdant mechanism of heme oxygenase-1 involves an increase in superoxide dismutase and catalase in experimental diabetes[J].Am J Physiol Heart CircPhysiol，2005，289(2)：701-707.

[6]劉璐，曹劍，李健，等.上調血紅素加氧合酶對糖尿病大鼠心功能的影響及可能機制[J].解放軍醫學院學報，2014，35(12)：1237-1240.

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The Protective Effect of Heme Oxygenase-1 in the Diabetic Cardiomyopathy※

Si lining，Liu Huiqin，Wang Xiaoli，Wang Cai，Zhuang Zhengyan，Gan Guifen*

(Affiliated Hospital of Qinghai University，Qinghai Xining 810000)

Objective To determine the molecular mechanism of the Heme Oxygenase-1(HO-1)plays a major protective role in streptozotocin(STZ)induced diabetic cardiomyopathy(DCM).Methods The diabetic mouse model was induced by consecutive peritoneal injections of STZ(50mg/kg).Blood glucose levels≥16.7mmol/L were defined as diabetes and routinely feed for 8 w.In the whole experiment process，the blood glucose，water intake，food intake，urine volume and body weight of the mice were monitored.The left ventricular function of the mice was detected by echocardiography.The mice were sacrificed by cervical dislocation and then the left ventricular myocardial was removed.The left ventricular myocardial was observed by electron microscopy and histopathological detection.The expression of ANP and BNP mRNA in the myocardium was detected by qRT-PCR.The Data were analyzed by statistics.Results Compared with the control group，there was a left ventricular cardiac dysfunction in the diabetic mice and overexpression of HO-1 was appeared in the control group than those in diabetic mice.Overexpression of HO-1 was alleviated myocardial structure changes.Myocardial ANP and BNP mRNA were decreased in HO-1 overexpressed mice compared with diabetic mice.Conclusion HO-1 can improve cardiac dysfunction and myocardial structural damage in DCM.

Diabetic cardiomyopathy Heme Oxygenase-1 Protective Effect

※：國家自然科學基金項目(項目編號：81060162)；國家自然科學基金項目(項目編號：81460284)；國家自然科學基金項目(項目編號：81460051)；青海省自然科學基金青年項目(項目編號：2014-ZJ-944Q)；青海省科技廳應用基礎研究項目(項目編號：2015-ZJ-744)*：通訊作者，主任醫師，xzhd1991@163.com 司立寧(1980～)，女，漢族，湖北籍，主治醫師

R587.2

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.03.006

2016-01-04