高粱抗絲黑穗病SCAR標記的建立

李玥瑩, 李春陽, 邢慧清, 張馨月, 逄洪波, 晏銘謠

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

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高粱抗絲黑穗病SCAR標記的建立

李玥瑩, 李春陽, 邢慧清, 張馨月, 逄洪波, 晏銘謠

(沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034)

選用高粱絲黑穗病感病恢復系矮四、抗病恢復系2381R以及二者F2代抗感個體為試驗試材,采用CTAB法提取高粱基因組DNA, 并應用RAPD篩選技術對高粱基因進行分子標記,選取了100對RAPD隨機引物對其進行擴增,有88對引物擴增出條帶。分析結果表明:88對引物中S405在抗感品種間擴增出差異譜帶。進一步對抗感群體進行分離分析,得出抗絲黑穗病基因重組率為11.7%。將S405擴增出的差異片段進行克隆測序,差異譜帶的片段長度為320 bp。根據差異譜帶的堿基排列順序,設計特異性引物,然后進行序列擴增,將RAPD分子標記轉化為SCAR分子標記,并將該標記命名為S405-320,為高粱優良品種的篩選和培育奠定一定的基礎。

高粱; 絲黑穗病; RAPD; SCAR

0 引 言

高粱[Sorghumbicolor(L) Moench]屬禾谷類作物,產量高,抗逆性強,具有抗旱、耐澇、耐鹽堿的特性[1],高粱植株各個部分都有潛在的利用價值,是重要的糧食作物、飼料作物以及生物燃料作物[2-3]。高粱絲黑穗病是影響高粱生產發展的重要病害之一[4-5],在各高粱產區均有發生, 給農業生產造成很大損失,嚴重制約高粱產業發展,實踐證明,選育抗病品種是防治絲黑穗病最為有效的途徑[6]。選育抗病品種是一項非常復雜的工作,傳統的方法育種效率不高[7],隨著分子生物學技術的迅猛發展,利用SSR(Simple Sequence Repeat)、RAPD(Random Amplified Polymorphism DNAs)及SCAR(Sequence characterized Amplified Region)等分子標記技術,找到感絲黑穗病品種和抗絲黑穗病品種之間的區別, 定位抗病基因,從本質上防治高粱絲黑穗病[8]。RAPD因具有樣品用量少,檢測速度快,靈敏度好,成本較低等優點,現已廣泛應用于生物的抗病品種的鑒定[9-11]。本研究利用RAPD分子標記技術對高粱抗、感絲黑穗病品種經行RAPD-PCR擴增,根據測序結果設計引物,將RAPD分子標記轉化為SCAR分子標記,提高RAPD的穩定性,這對抗絲黑穗病品種的選育具有較大的實用價值,為高粱優良品種的篩選和培育提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 實驗材料

高粱絲黑穗病感病恢復系矮四,抗病恢復系2381R,以及其二者經去雄雜交、自交的后代2381R/矮四群體(感病20株,抗病40株),均由遼寧省農業科學院提供。

1.1.2 實驗儀器

高速冷凍離心機,PCR擴增儀,電泳槽,微量移液槍,紫外凝膠成像,電子分析天平,微波爐,水浴鍋,制冰機等。

1.1.3 實驗試劑

TBE電極緩沖液,CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)緩沖液,EB(溴化乙錠),氯仿/異戊醇,溴酚藍溶液,異丙醇,瓊脂糖,75%乙醇,10 mmol/L dNTPs,5 U/μL Taq酶,100條隨機引物(S401-S500)購自上海生工生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 試材培養

將高粱種子浸泡8 h,然后將其種植于花盆中,在光照培養箱中進行培養,溫度設為28 ℃,濕度設為75%,光照培養13 h,黑暗培養11 h。培養一周后采摘高粱苗期葉片,進行DNA的提取實驗。

1.2.2 高粱DNA的提取

采用CTAB法[12-14]提取高粱苗期葉片的總DNA。

1.2.3 DNA純度檢測

取7 μL提取的DNA于1%含0.5 μg/mL EB的瓊脂糖凝膠中電泳,電壓設為100 V,電泳30 min,在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照,檢測DNA的譜帶情況。

1.2.4 近等基因池的建立

采用分離群體分組分析法(BSA法)對高粱抗感絲黑穗病群體進行分析[15]。感池由20株感絲黑穗病株葉片,抗池由40株抗絲黑穗病株葉片所提取的DNA,各取1 μL混勻而成。

1.2.5 RAPD-PCR反應條件

PCR擴增反應體系(25 μL):ddH2O 17.0 μL,MgCl22.5 μL(25 mmol/L),10×Buffer 2.5 μL,DNA模版(25 ng/μL)1.0 μL ,dNTPs(10 mmol/L)0.5 μL,Taq酶(5 U/μL)0.5 μL,引物(10 μmol/μL)1.0 μL。

反應條件:

94 ℃預變性 3 min

72 ℃延伸 10 min

1.2.6 產物檢測

取RAPD-PCR產物5 μL于1.5%含0.5 μg/mL EB的瓊脂糖凝膠中電泳,電壓100 V,電泳60 min,在紫外凝膠成像儀中觀察并拍照,檢測PCR產物有無降解情況。

1.2.7 多態性片段的回收及克隆測序

回收引物擴增的條帶,PCR擴增,送大連寶生物公司進行克隆測序。

1.2.8 SCAR標記的建立

根據測序結果,在序列的兩端設計特異性SCAR引物。

SCAR-PCR反應體系(25 μL):ddH2O 17 μL,MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL,10×Buffer 2.5 μL,dNTPs(10 mmol/L)1.0 μL,Taq酶(5 U/μL)0.25 μL,引物引物Ⅰ(10 μmol/μL)0.5 μL,引物Ⅱ(10 μmol/μL)0.5 μL,DNA模版(100 ng/μL)1.0 μL。

反應條件:

95 ℃預變性 3 min

72 ℃延伸 10 min

1.2.9 共分離分析

重組率(r)=交換個體數/(抗絲黑穗病群體數+感絲黑穗病群體數)×100%

遺傳距離(cM)=[1/4*ln(1+2r)/(1-2r)]*100

2 結果與分析

2.1 DNA純度檢測

圖1 DNA的提取檢測結果Fig.1 The detection result of DNA extraction

采用瓊脂糖凝膠電泳法對提取的DNA質量進行檢測,結果表明提取出的DNA沒有降解,純度符合實驗要求,結果如圖1所示,可用于接下來的RAPD-PCR實驗。

2.2 高粱抗絲黑穗病基因的RAPD分析

選取100條(S401-S500)RAPD隨機引物,對親本、感池、抗池和后代群體的DNA模板進行RAPD分析。結果表明:12條引物沒有擴增出條帶,88條引物擴增出條帶,擴增率為88%。擴增結果如圖2所示,從左至右,分別是Marker,引物S401、S403、S405、S421、S422、S442的擴增結果。每條引物擴增的4個條帶從左至右分依次是抗絲黑穗病親本、感絲黑穗病親本、抗絲黑穗病基因池和感絲黑穗病基因池的擴增條帶。其中引物S405擴增條帶具有多態性,在抗親、抗池比感親、感池多擴增出一條譜帶,在320 bp左右。其他引物并沒有發現DNA片段長度多態性。

圖2 引物 S401、S403、S405、S421、S422、S442的PCR擴增結果

2.3 高粱抗絲黑穗病基因RAPD多態性差異的共分離分析

對引物S405進行共分離分析, 分析了F2代分離群體60株(感病20株,抗病40株)。 擴增結果見表1,在感絲黑穗病群體中,有5株擴增出了多態性片段。在抗絲黑穗病群體中,有2株沒有擴增出多態性片段,得出重組率為11.7%,遺傳距離為11.9 cM,該片段與抗病基因緊密連鎖。

表1 S405擴增片段多態性在F2代中的共分離分析Tab.1 Co-segregation analysis of amplified polymorphism fragment in F2 using primer S405

S405引物在抗病和感病群體的單株部分擴增結果見圖3。

圖3 引物S405的PCR部分擴增結果

2.4 多態性片段的回收及克隆測序

圖4 S405回收的片段Fig.4 The recycling polymorphism fragment of S405

將引物S405擴增的多態性片段回收純化,電泳結果如圖4所示。回收的片段長度為320 bp與目標片段的大小相同,并進行了克隆測序。

圖5 S405的SCAR標記對部分單株的檢測結果抗親(1),感親(2),F2抗單株(6～10),F2感單株(41～45)Fig.5 The PCR detection for some individuals with the specific S405 SCAR primers Marker Resistant parent(1), Susceptible parent(2), F2 resistant-segregation individuals(6～10),F2 susceptible segregation individuals(41～45)

2.5 SCAR標記的建立

2.5.1 SCAR引物的設計

根據測序結果,合成了SCAR的引物,序列如下:

S405F:5′-TCGCTAACACGCACACCTAA-3′

S405R:5′-GAACGTGTTGGGGAACAAGG-3′

2.5.2 SCAR標記檢測結果

用2.5.1的一對引物對父母本及F2代抗感個體單株進行PCR擴增,結果表明SCAR標記與高粱抗絲黑穗病基因的RAPD標記的連鎖性相比無變化,結果如圖5所示,1為抗絲黑穗病親本、2為感絲黑穗病親本、6～10為F2抗絲黑穗病單株、41～45為F2感絲黑穗病單株,其中抗絲黑穗病親本和抗絲黑穗病單株都擴增出了譜帶,長度約為320 bp;感絲黑穗病親本和感絲黑穗病單株都沒有擴增出任何普帶。PCR產物都只為一條320 bp的譜帶,說明了SCAR標記的特異性強,并且F2單株擴增結果表明遺傳距離和RAPD擴增結果一致,這證明成功的把RAPD分子標記轉化為了重復性好、穩定性好的SCAR標記。

3 結 論

3.1 抗絲黑穗病基因的RAPD分析

本實驗隨機選取了100個RAPD引物對高粱絲黑穗病感病恢復系矮四、抗病恢復系2381R和感病群體、抗病群體進行RAPD擴增。結果顯示:在100個隨機引物中,有88個引物能對DNA擴增出條帶,擴增率為88%。經過實驗得出S405在感絲黑穗病親本與抗絲黑穗病親本、感絲黑穗病基因池與抗絲黑穗病基因池之間的多態性條帶一致;對其進行RAPD多態性差異的共分離分析,得出S405與抗絲黑穗病基因的重組率為11.7%,遺傳距離為11.9 cM。

3.2 將RAPD分子標記轉化為SCAR標記的分析

將引物S405擴增的多態性片段進行測序,結果表明片段長度約為320 bp。進一步設計了SCAR引物,應用SCAR引物對抗、感病群體的單株進行擴增,擴增結果表明其連鎖性與RAPD分子標記一致,證明RAPD標記已經成功轉化為SCAR標記。

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Research on establishment of head smut of sorghum by using SCAR marker

LIYueying,LIChunyang,XINGHuiqing,ZHANGXinyue,PANGHongbo,YANMingyao

(College of Life Science, Shenyang Nomal University, Shenyang 110034, China)

The DNA of the sorghum Head Smut disease-resistant restorer lines and susceptible-resistant restorer lines dwarf four, Head Smut resistance and susceptibility was extracted by CTAB method and marked with molecular marker to sorghm gene by RAPD in this paper. In the optimal RAPD reaction system, 100 random primers were used to screen the markers linked to the resistance gene, 88 pairs amplified products. The results show that S405of 88 pairs of primers between disease-resistant and susceptible-resistant cultivars are amplified differences bands, further segregation analysis the resistance gene to Head Smut was 11.7 %. S405amplified polymorphic bands were cloned and sequenced with the length of 320 bp. According to the nucleotide sequences of differences bands to design specific primer was designed for perform PCR, the RAPD markers were succeeded conversing to SCAR marker, the marker named S405-320, to lay a foundation for the selection and cultivation of improved varieties of sorghum.

sorghum; head smut; RAPD; SCAR

2016-01-09。

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2012387); 沈陽市科技局科技計劃項目(F15-1991--22).

李玥瑩(1966-),女,遼寧沈陽人,沈陽師范大學教授,博士。

1673-5862(2016)04-0468-05

S432

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2016.04.019