呼吸道銅綠假單胞菌感染病灶藻酸鹽合成相關基因的表達*

陜西省第二人民醫院呼吸內科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍 費春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

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呼吸道銅綠假單胞菌感染病灶藻酸鹽合成相關基因的表達*

陜西省第二人民醫院呼吸內科 (西安 710005) 陳張琴 王 靜 許映龍?費春麗 李 瑛 劉小荔 楊 淼

目的:獲得一種呼吸道銅綠假單胞菌生物膜檢測方法，探討藻酸鹽合成相關基因的表達對臨床治療的影響。方法:提取60例呼吸道銅綠假單胞菌感染患者氣管內病變組織，實時熒光定量PCR檢測藻酸鹽合成相關基因algD、algB、algU、mucA的表達，60例患者根據是否耐藥分組,分為耐藥組(R組)40例，非耐藥組(NR組)20例，根據治療的難易程度，將60例患者分為治療困難組(D組)38例，治療容易組(E組)22例。并進行基因algD、algB、algU、mucA的表達與臨床抗生素耐藥及治療難易之間的相關性分析。結果:經細菌培養證實的銅綠假單胞菌感染病例60例，呼吸道病變組織均有algD、algB、algU、mucA基因的表達；耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)對比，algD、algU表達有統計學差異，algB、mucA表達無統計學差異；容易組(E組)和困難組(D組)對比，algD、algU、algB、mucA差異無統計學意義；細菌耐藥和治療難易的相關性分析顯示，細菌耐藥和臨床治療難易相關。結論：algD與銅綠假單胞菌藻酸鹽的合成有著直接的正相關性，可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據，而algU與algD的表達有正相關性。

本實驗選取細菌培養證實的呼吸道銅綠假單胞菌感染病例，內鏡下氣管或支氣管內取材，行生物膜形成相關基因及調節基因的檢測。藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質的主要成分之一，algD基因對藻酸鹽合成起關鍵作用，而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達，使藻酸鹽大量生成。algB、algU促進algD表達。報道如下。

材料與方法

1 標 本 選擇2013年1月至2015年12月我院部分臨床痰液細菌培養證實為銅綠假單胞菌感染病例，男42例，女18例，年齡37～83歲，平均年齡68歲。氣管內鏡下收集標本，可為肉芽、病變壞死組織或氣管內痂皮等，保存液保存。

2 主要實驗器材和試劑 7300 Real Time PCR System(美國Applied Biosystems公司);臺式高速冷凍離心機Neofuge 15R(Heal Force);Trizol Reagent(Invitrogen Life Technologies 15596-026)。RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo #K1622)。FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche 04 913 914 001);引物(Invitrogen Biotechnology Co.LTD);三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司 10006818);異丙醇(國藥集團化學試劑有限公司 80109218);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司 10009218)。

3 引物序列 見表1。

表1 引物序列

4 實驗步驟 按試劑盒說明書進行操作，步驟如下：①Trizol Reagent 抽提總RNA；②以oligo(dT)15反轉錄獲得cDNA；③ 定量PCR：預變性95℃，10min；循環(40次)95℃，15s→60℃，60s；末段延伸60℃，5min；溶解曲線 75℃→95℃，每20s升溫1℃;④ 結果處理：?CT =CT(目的基因，待測樣本)- CT(內標基因，待測樣本)

結 果

1 60例患者細菌培養 60例均證實為銅綠假單胞菌感染病例，氣管內肉芽或病變組織取材后PCR實驗結果，均有algD、algB、algU、mucA基因的表達。

2 藥物敏感實驗結果 將60例病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)，algD、algU在兩組間表達有統計學差異(P<0.05)，algB、mucA差異無統計學差異(P>0.05)，見表2。

3D組和E組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較 以臨床治療后癥狀體征是否容易改善，將60例病例分為容易組(E組)和困難組(D組)，兩組間△CT均值對比的t檢驗提示，algD、algU、algB、mucA差異無統計學意義(P>0.05)

4 耐藥和治療難易相關性分析 對耐藥和治療難易的相關性分析顯示(P<0.05)，說明耐藥和臨床難易有關。

表2 R組和NR組△CT=CT目的基因-CTβ-actin比較

討 論

能形成生物膜的細菌主要有銅綠假單胞菌、克雷伯氏菌、腸桿菌、沙雷氏菌屬、肺炎鏈球菌、葡萄球菌等, 相關感染尤以銅綠假單胞菌、金葡球菌多見。

在肺部銅綠假單胞菌感染的抗生素治療方面，抗生素的選擇多是根據藥物敏感實驗的結果，該方法不一定奏效，因為臨床細菌培養多采用浮游模式，而事實上呼吸道銅綠假單胞菌生長多是以細菌生物膜的方式形成黏液層。即使浮游狀態細菌對抗生素敏感，生物膜狀態的細菌則仍然能抵抗高濃度的“敏感”抗生素[1]。盡管目前尚無可靠證據，但理論上基于考慮生物膜形式而選擇的抗生素，應該優于傳統的細菌培養及藥物敏感試驗而選擇抗生素[2]。

細菌生物膜感染的概念提出有數十年，目前尚未開發出能提供臨床應用的生物膜常規檢查和指導治療的方法[3]。科學家們試圖找到銅綠假單胞菌生長方式和控制機制，并提出避免生物膜形成或促進生物膜瓦解的方法[4]。

藻酸鹽是銅綠假單胞菌生物膜胞外多聚基質的主要成分之一，algD基因對藻酸鹽合成起關鍵作用，而mucA基因的突變可造成algD的去阻遏表達，使藻酸鹽大量生成。銅綠假單胞菌藻酸鹽形成的調控主要是轉錄水平對algD基因啟動子的調控，algB屬于NTRC家族，可直接綁定到algD啟動子而促進藻酸鈉生產[5]。

mucA-algU是銅綠假單胞菌生物膜合成的主要調控徑路。mucA突變型菌株,algU不再受到抑制，從而促進下游啟動子的活化。algU的過表達促進algD的啟動，在銅綠假單胞菌黏液型菌株mucoidisolates和非黏液型菌株non-mucoidisolates表達有顯著差異。

本實驗患者均為選取細菌培養證實為銅綠假單胞菌感染病例，氣管內肉芽或病變組織取材后PCR實驗結果，均有上述相關基因的表達，而程度有差異。以藥物敏感實驗結果為標準，將病例分為耐藥組(R組)和非耐藥組(NR組)，algD、algU表達在兩組間比較有統計學差異，algB、mucA差異無統計學意義；說明algD表達與生物膜合成最為相關，而直接影響培養細菌的耐藥性，algU與algD表達有比較明確的正相關性。mucA表達下降可以解除對algU的抑制，從而促進algD表達，algB通過綁定algD啟動子而促進藻酸鹽的合成。本實驗兩組mucA、algB表達差異均無統計學意義，說明mucA、algB與algD之間可能缺少直接的因果關系。

至于分為容易組(E組)和困難組(D組)，各種基因表達的比較均沒有統計學差異，以及耐藥和臨床難治有關的結論，由于分類標準的量化不能精確，并且臨床治療效果影響因素很多，除了性別、年齡、既往病史，甚至呼吸機的模式和護理水平均可能為混雜因素，所以不能得出非常可靠的結論。總之，algD與銅綠假單胞菌生物膜的合成有著直接的正相關性，可以作為判斷是否有黏液型銅綠假單胞菌生長及生物膜形成的依據，而algU與algD有正相關性。

針對生物膜的治療Yamasaki 等發現羅紅霉素和亞胺硫霉素合用能有效殺滅金黃色葡萄球菌生物膜。羅紅霉素和氟羅沙星對銅綠假單胞菌生物膜有明顯抑制作用,兩者合用可治療由銅綠假單胞菌生物膜引起的難治性感染,其中羅紅霉素通過抑制細菌多糖蛋白復合物合成來增強氟羅沙星對生物膜的滲透,對氟羅沙星殺滅生物膜中細菌起增效作用。體外實驗證明乳鐵蛋白協同木糖醇對銅綠假單胞菌生物膜有協同治療作用。麥盧卡蜂蜜和肉桂油等均有此類治療方面的研究。是否能以algU與algD的表達作為上述治療效果的判斷指標有待進一步的研究。

[1 ] Lebeaux D, Ghigo JM, Beloin C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 2014,78(3):510-543.

[2] Waters V, Ratjen F. Standard versus biofilm antimicrobial susceptibility testing to guide antibiotic therapy in cystic fibrosis[J].Cochrane Database Syst Rev,2015, 5(3):CD009528.

[3] Hφiby N.A personal history of research on microbial biofilms and biofilm infections[J]. Pathog Dis,2014,70(3):205-211.

[4] Rasamiravaka T, Labtani Q, Duez P,etal.The formation of biofilms by Pseudomonas aeruginosa: a review of the natural and synthetic compounds interfering with control mechanisms[J]. Biomed Res Int,2015,759348.

[5] Leech AJ, Sprinkle A, Wood L,etal. The NtrC family regulator AlgB, which controls alginate biosynthesis in mucoid Pseudomonas aeruginosa, binds directly to the algD promoter[J]. J Bacteriol,2008,190(2):581-589.

(收稿：2016-08-09)

Expression of alginate biosynthesis-related genes in respiratory Pseudomonas aeruginosa infection lesions Shaanxi Provincial People's Hospital Respiratory Medicine

(Xi’an 710005)

Chen Zhangqin Wang Jing Xu Yinglong et al

Objective：To obtain a respiratory Pseudomonas aeruginosa biofilm detection methods, explore the affect of the expression of the related alginate synthesis genes to the clinical treatment. Methods：Specimens were taken from the tracheal lesions of Pseudomonas aeruginosa infection cases, real-time quantitative PCR was performed to detect the expression of alginate biosynthesis-related gene algD, algB, algU, mucA. And correlation between gene algD, algB, algU, mucA. Expression and clinical treatment effect and antibiotic resistance was statistically analysed. Results：For all of the bacterial culture confirmed Pseudomonas aeruginosa infection cases, the alginate biosynthesis-related gene Expression was detected; comparison of resistant group (R group) and non-resistant group (NR group), algD, algU expression significantly difference, algB, mucA difference was not significant. Conclusion：Expression of algD and Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis has a direct positive correlation. Detect of algD can be used to determine whether there is Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. and the expression of algU have a positive correlation with algD.

Pseudomonas aeruginosa @algD @mucA+

*陜西省科學技術廳基金(2012k17-03-04)

銅綠假單胞菌 @algD@mucA+

R

Adoi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.004

?西安交通大學醫學院第二附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科病院