瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性研究*

武漢大學(xué)人民醫(yī)院(武漢 430060) 凌 偉 于紅剛 張海菊

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·論著·基礎(chǔ)研究·

瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性研究*

武漢大學(xué)人民醫(yī)院(武漢 430060) 凌 偉 于紅剛 張海菊

目的：探討瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系。方法： 隨機(jī)選取89例胃癌患者作為研究對(duì)象，97例健康體檢者作為正常對(duì)照，采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)瘦素受體基因rs1137100 和 rs1137101位點(diǎn)的多態(tài)性，同時(shí)運(yùn)用ELISA法測(cè)定血清瘦素水平。結(jié)果：胃癌組瘦素受體基因rs1137100位點(diǎn)的AA基因型和A等位基因明顯降低罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833)。rs1137101位點(diǎn)AA和GA基因型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯相關(guān)性。但是，位點(diǎn)rs1137101的A等位基因可能會(huì)降低胃癌的發(fā)病幾率(P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。胃癌組血清瘦素水平明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性密切相關(guān)，瘦素受體基因rs1137100 和rs1137101的A等位基因可能會(huì)降低胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

胃癌是常見高病死率及高發(fā)病率的惡性腫瘤。中國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū), 胃癌發(fā)病率居全球第二位[1]。最近,胃癌的發(fā)生有年輕化趨勢(shì),給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。然而迄今為止,胃癌的病因及發(fā)病機(jī)制仍不甚清楚。已有研究報(bào)道，在人的胃粘膜組織及胃癌細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)瘦素(Leptin)和瘦素受體(LEPR)表達(dá)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，瘦素具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和分化作用[3]。本研究檢測(cè)胃癌患者血清瘦素水平，同時(shí)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)來檢測(cè)瘦素受體基因rs1137100 及 rs1137101位點(diǎn)變異，探討瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性關(guān)系，為胃癌的防治提供理論依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 一般資料：病例來源于2013年3月至2014年9月在武漢大學(xué)人民醫(yī)院就醫(yī)的胃癌患者。胃癌患者符合如下條件：沒有其他惡性腫瘤病史,無自身免疫性疾病, 并通過內(nèi)鏡形態(tài)和組織病理學(xué)檢查無同時(shí)并發(fā)惡性腫瘤,血液采樣之前未接受放療和化療。對(duì)照組的人群選擇在同一時(shí)期在醫(yī)院接受體檢,并沒有任何的消化系統(tǒng)疾病。隨機(jī)選擇了89例胃癌患者，與此同時(shí),募集97例健康人作為對(duì)照組。兩組一般情況無顯著差異(P>0.05),具有可比性。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料及儀器：瘦素ELISA試劑盒由康肽生物科技(北京)有限公司提供，人全血DNA提取試劑盒購(gòu)自荷蘭QIAGEN公司，反應(yīng)引物應(yīng)用Primer 5.0軟件完成初步設(shè)計(jì)，再交給上海基康(GeneCore)生物技術(shù)有限公司合成，內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)fermentas公司，PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PE. Applied Biosystems公司產(chǎn)品，生化指標(biāo)用日本OLYMPUSA U-1000全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

2 方 法

2.1 血清瘦素水平及血脂測(cè)定：抽取清晨空腹靜脈血液檢測(cè)血脂指標(biāo)，同時(shí)留取2ml靜脈血離心后取上清液，采用ELISA法測(cè)血清瘦素水平。

2.2 瘦素受體基因多態(tài)性檢測(cè)：①DNA提?。喝∪虢M者外周血0.5ml,2% EDTA抗凝，用荷蘭QIAGEN公司DNA試劑盒提取DNA。②LEPR引物設(shè)計(jì)：參照文獻(xiàn)[4]， rs1137100位點(diǎn)引物序列為：正向: 5' - ACTTTTCTAACTTATCCAA - 3'；反向:5' - ATAAGTTAGAAAAGTGAGTA - 3'， rs1137101位點(diǎn)的引物序列為：正向:5' - AGGCAGTTTTCAGATGGTTC - 3'；反向:5' - GTGAACCATCTGAAAACTGC - 3'。③PCR擴(kuò)增：PCR反應(yīng)體系25 μl，其中樣本DNA5.0 μl，正向引物0.4 μl，反向引物0.4 μl，Tag DNA聚合酶0.3 μl，氯化鎂(MgCl2)2.5 μl ，10倍緩沖溶液2.5 μl，4×dNTPs 0.5 μl ，無菌水13.4 μl。PCR擴(kuò)增法：95℃預(yù)變性5min，95℃變性40s，，56℃退火30s，70℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。④ RFLP分析：用Mspl酶消化PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳分析酶切片段，紫外透視儀下觀察帯型。rs1137100位點(diǎn)有三種基因型，分別為AA基因型(175 bp)，AG基因型(203 bp、175 bp)、GG基因型(203 bp)。rs1137101位點(diǎn)也包含三種基因型，分別是 AA基因型(416 bp)，AG基因型(416 bp、292 bp、124 bp)， GG基因型(292 bp、124 bp)。

結(jié) 果

1LEPR基因多態(tài)性結(jié)果 兩組間基因型GG、AG、AA的觀察值和預(yù)期值Hardy-Weinberg平衡吻合度良好(P>0.05)，符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示個(gè)體間無血緣關(guān)系。

2 胃癌組與健康對(duì)照組一般臨床資料比較 兩組的性別、年齡、血脂水平無顯著差異(P>0.05)，胃癌組瘦素水平較正常對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 兩組瘦素受體基因型和等位基因頻率的分布比較LEPRrs1137100位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在胃癌組和對(duì)照組之間分布有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。rs1137100 、rs1137101中AA的基因型頻率均明顯低于對(duì)照組 (P<0.05)。rs1137100 和rs1137101多態(tài)性中的A等位基因與胃癌易感性存在顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，可能會(huì)降低患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833;OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802)。而且，rs1137100序列中的AA基因型能顯著降低胃癌的易感性(OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987)。但是，rs1137101 序列中的AG、AA基因型和胃癌易感性沒有明顯關(guān)聯(lián)，見表2。

表1 LEPR rs1137100基因型頻率和等位基因分布頻率

表2 LEPR rs1137101基因型頻率和等位基因頻率

4LEPR基因型對(duì)瘦素水平影響LEPRrs1137100 位點(diǎn)GG基因型攜帶者瘦素水平明顯高于AA和AG基因型攜帶者(11.41±1.35vs8.27±2.13kg/m2, P<0.05 )，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，rs1137101位點(diǎn)不同基因型攜帶者的瘦素水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05 )。

討 論

瘦素是肥胖基因編碼的一種多靶器官、功能廣泛的蛋白激素，其主要通過與LEPR結(jié)合來調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝及脂肪沉積。LEPR彌漫表達(dá)于各組織細(xì)胞中，其基因存在多種變異。在人的胃粘膜組織及胃癌細(xì)胞中研究已發(fā)現(xiàn)有瘦素和LEPR的表達(dá)[4]，這提示瘦素及其受體對(duì)胃癌發(fā)生可能起到重要作用。趙亮等[5]發(fā)現(xiàn)在胃腺癌細(xì)胞中可檢測(cè)到LEPR異構(gòu)體mRNA的表達(dá)。LEPR基因長(zhǎng)度約5.1kb,可以編碼1165個(gè)氨基酸[6]。在先前的報(bào)道中，LEPR基因中位點(diǎn)rs1137100(Lys109Arg、位于2號(hào)外顯子)和位點(diǎn)rs1137101(Gln223Arg、位于4號(hào)外顯子)的多態(tài)性是研究熱點(diǎn)。他們都與許多疾病有關(guān)[7],包括胃癌。LEPR基因變異發(fā)生于受體編碼胞外區(qū)第一個(gè)細(xì)胞因子域內(nèi)，該變異導(dǎo)致配體及受體間的親和力受到影響，從而改變了瘦素的生物學(xué)效應(yīng)。有研究提出LEPR基因多態(tài)性導(dǎo)致胃癌發(fā)病的機(jī)制可能是：LEPR基因變異發(fā)生于胞內(nèi)區(qū),通過激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-2和STAT等眾多信號(hào)通路,從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞增殖。韓國(guó)一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LEPR基因多態(tài)性與胃癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，國(guó)內(nèi)應(yīng)俊、任曉華等[8]研究也表明LEPR多態(tài)性會(huì)增加罹患胃癌風(fēng)險(xiǎn)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，胃癌組中rs1137100位點(diǎn)是AA基因型明顯減少,表明AA基因型降低了胃癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，而AG基因型和胃癌之間沒有顯著相關(guān)性。位點(diǎn)rs1137100的A等位基因會(huì)降低49.3%胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這與韓國(guó)研究結(jié)果有所不同，他們認(rèn)為基因型GA與基因型AA相比，罹患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加2.926倍。然而,另一個(gè)研究表明,G等位基因增加脊髓脊膜突出風(fēng)險(xiǎn),這與我們結(jié)果相似。我們的結(jié)果還表明，雖然位點(diǎn)rs1137101的AA基因型在病例組中偏低,但與胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)，然而位點(diǎn)rs1137101的A等位基因卻可能會(huì)降低罹患胃癌風(fēng)險(xiǎn)。這個(gè)結(jié)果與那些認(rèn)為位點(diǎn)rs1137101與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)的研究有所不同。另外，我們發(fā)現(xiàn)rs113710位點(diǎn)GG基因型胃癌患者瘦素水平明顯高于AA和AG基因型，提示LEPRrs1137100位點(diǎn)多態(tài)性可能與胃癌患者體內(nèi)高瘦素血癥有關(guān)。推測(cè)其機(jī)制可能是，胃癌患者體內(nèi)LEPRrs1137100變異，致使瘦素受體的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，誘發(fā)瘦素抵抗，進(jìn)而引起高瘦素血癥，高瘦素血癥則通過細(xì)胞信號(hào)通路介導(dǎo)促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管增生，最終導(dǎo)致胃癌易感性增加。而rs1137101位點(diǎn)多態(tài)性則與瘦素水平無明顯相關(guān)。

本次研究證實(shí)了瘦素受體基因位點(diǎn)rs1137100和rs1137101的多態(tài)性與胃癌易感性之間存在關(guān)聯(lián)，并且發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs1137100 和位點(diǎn)rs1137101的A等位基因都可能會(huì)降低胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。由于瘦素受體基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜、眾多變異且因地域、人種不同而差異，加之各個(gè)研究方法的不同，最后導(dǎo)致研究結(jié)果迥異。并且，胃癌發(fā)生發(fā)展是極其復(fù)雜的過程，多因素參與其中，單個(gè)基因、位點(diǎn)的突變常僅僅作用于發(fā)病的某個(gè)環(huán)節(jié)，并不足以致病。因此對(duì)于瘦素受體基因多態(tài)性與胃癌易感性的關(guān)系，尚需擴(kuò)大研究對(duì)象來源和樣本量作進(jìn)一步廣泛而深入研究。

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(收稿：2016-06-19)

The relationship of leptin receptor gene polymorphisms with the susceptibility of gastric cancer

Ling Wei Yu Honggang Zhang Haiju

Renmin Hospial of Wuhan University(Wuhan 430060)

Objective:To analyze the relationship between the leptin receptor (LEPR) gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) with gastric cancer (GC) susceptibility. Methods:Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) was utilized to analyze the polymorphisms of rs1137100 and rs1137101 in 89 GC patients and 97 healthy controls. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detecte the leptin levels in blood. Results:AA genotype and A allele of LEPR rs1137100 were significantly decreased the GC risk (P=0.036, OR=0.259, 95%CI=0.068-0.987;P=0.008, OR=0.493, 95%CI=0.291-0.833). No obvious correlation have existed between LEPR rs1137101 AA and GA genotypes and the risk of GC. But, rs1137101 A allele might reduce the GC risk (P=0.006, OR=0.446, 95%CI=0.248-0.802). The serum leptin level in GC group was higher than that in the controls (P<0.05). Conclusion :The leptin level and LEPR gene polymorphisms (rs1137100 and rs1137101) is highly correlated with susceptibility of GC,A allele of rs1137100 and A allele of rs1137101 might decrease the GC risk.

Stomach neoplasms Leptin @Gene polymorphism

*國(guó)家自然科學(xué)基金(81272693)

胃腫瘤 瘦素 @基因多態(tài)性

R735.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.12.001