柴胡疏肝散對肝氣郁結(jié)證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

馬玉峰，王嘉麟，邢 佳，朱曉晨，岳廣欣，王玉來，郭蓉娟，賀立娟

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

柴胡疏肝散對肝氣郁結(jié)證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響

馬玉峰1，王嘉麟2，邢 佳2，朱曉晨2，岳廣欣3，王玉來2，郭蓉娟2，賀立娟2

目的 研究柴胡疏肝散對肝郁證大鼠行為學(xué)和大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響。方法 用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝郁證大鼠模型，測評開野、蔗糖水實驗，采用高效液相色譜法測定大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)。結(jié)果 模型組大鼠的行為學(xué)發(fā)生了明顯變化，海馬及下丘腦中5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、多巴胺(DA)含量均下降，去甲腎上腺素(NE)含量呈增加趨勢，而柴胡疏肝散能調(diào)控其變化趨勢。結(jié)論 柴胡疏肝散能改善肝郁證大鼠行為學(xué)的變化，具有治療肝郁證的作用，其作用機制可能與其能夠調(diào)節(jié)肝郁證大鼠腦5-HT、5-HIAA、NE、DA有關(guān)，從而有效發(fā)揮抗肝郁作用。

肝氣郁結(jié)證；柴胡疏肝散；單胺類神經(jīng)遞質(zhì)；5-羥色胺；5-羥吲哚乙酸；多巴胺

本實驗用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立了肝氣郁結(jié)證(肝郁證)大鼠模型，觀察柴胡疏肝散對該模型行為學(xué)和大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響，為進一步探討肝郁證的內(nèi)涵提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠40只，體重180 g±10 g，SPF/VAF級，動物許可證號：SCXK(京)2006-0009，由北京維通利華實驗動物中心提供。光照節(jié)律12L：12D (07：00～19：00)，室溫22 ℃±1 ℃，空氣濕度40%～50%，給予常規(guī)顆粒飼料及飲用水，實驗環(huán)境安靜舒適。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，5只/籠。

1.2 藥物 本實驗所用柴胡疏肝散出自《景岳全書·古方八陣》，組方：柴胡6 g，陳皮6 g，川芎5 g，香附5 g，枳殼5 g，白芍5 g，甘草3 g。由解放軍總醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)藥劑科鑒定均為正品，經(jīng)冷水浸泡藥材2 h，常規(guī)兩煎，頭煎30 min，二煎20 min，將兩次水煎液混合并過濾，經(jīng)水浴蒸發(fā)濃縮成含生藥0.52 g/mL的濃縮藥液冷藏備用。大鼠給藥劑量按人與動物體表面積折算(參考《藥理實驗方法學(xué)》第4版)，灌胃容積按1 mL /100 g換算。

1.3 儀器 美國ESA公司的5600A型高效液相色譜系統(tǒng)；8通道庫侖電化學(xué)檢測器(Model 5600A Coularray Detector-8)；電極：ESA Model 6210 fourchannel cell；582型泵；軟件：ESA Software Version；Sigma-3K15超速低溫離心機；NANOpure Diamond超純水機；MJ-300超聲波發(fā)生器；AG285電子分析天平；KONTES微量電動勻漿器；自制敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)。

1.4 試劑 蔗糖(分析純，北京化學(xué)試劑有限公司提供)，溶于蒸餾水中配制成1%蔗糖溶液；去甲腎上腺素(NE，sigma A9512)；3，4-二羥基苯乙酸(DOPAC，sigma 850217)；多巴胺(DA，sigma H8502)；高香草酸(HOMV，sigma H1252)；5-羥色胺(5-HT，sigma 9523)；5-羥吲哚乙酸(5-HIAA，sigma H8876)；3，4二羥基芐胺(DHBA，sigma 37616)；1-辛烷磺酸鈉(TEDIA)；一水檸檬酸；乙腈(Thermo)；高氯酸；焦亞硫酸鈉；乙二胺四乙酸，實驗用水為超純水。

1.5 方法

1.5.1 模型建立及分組 40只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進行開野實驗(Open-field test)，將合格且評分相近的30只大鼠隨機分為3組：空白對照組(對照組)、肝郁證模型組(模型組)、柴胡疏肝散組(治療組)，每組10只。模型建立：參照文獻[1-3]，用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法建立肝郁證大鼠模型。將造模大鼠放入特制的細鋼絲網(wǎng)籠內(nèi)，使其行走困難、活動受限，束縛籠空間大小可調(diào)節(jié)；隨之將被束縛的大鼠放入小型鼠籠，1只/籠。每日束縛制動1次，每次束縛6 h(其余時間單籠孤養(yǎng))，每日開始時間隨機，連續(xù)21 d。造模大鼠在束縛期間禁食水。

1.5.2 干預(yù)措施 對照組：群養(yǎng)，5只/籠，不做任何刺激，生理鹽水灌胃，每日1次；模型組：細鋼絲網(wǎng)籠束縛結(jié)合孤養(yǎng)，生理鹽水灌胃，每日1次；治療組：細鋼絲網(wǎng)籠束縛結(jié)合孤養(yǎng)，柴胡疏肝散煎劑(0.52 g/mL)灌胃，每日1次。自造模之日起開始灌胃，灌胃時間為21 d。

1.5.3 行為學(xué)測定 開野實驗，用Open-field test法進行測試。由兩位評定者評定每只大鼠在3 min內(nèi)的運動情況。蔗糖水實驗[4]，分別在造模前1 d和造模第22 天測定各組大鼠的蔗糖水偏好值[糖水偏好值=糖水消耗量/總液體消耗量×100%]。

1.5.4 前額葉皮質(zhì)、海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化

1.5.4.1 組織樣品制備 3組實驗大鼠均于末次給藥第2天上午，10%水合氯醛麻醉后斷頭處死，從枕骨大孔向口腔側(cè)進刀，剪開顱骨，剝?nèi)ヮ^頂骨，剪斷視神經(jīng)，用鑷子取出整個腦組織，迅速以預(yù)冷的人工腦脊液沖去腦組織表面的血液，用濾紙吸去血液及多余的腦脊液。參照George Paxions的大鼠腦立體定位圖譜[5]定位，在冰盤上剝離大腦，取前額葉皮質(zhì)、海馬及下丘腦，標記稱重后分別裝入1.5 Ml Eppendorf管，放置于液氮或-80 ℃冰箱保存，待樣品集齊后成批檢測。檢測前將稱重后的腦組織(20 mg～50 mg)，加0.5 mL預(yù)冷的工作內(nèi)標液，于冰浴下用電動微量勻漿器快速勻漿，靜置10 min，4 ℃條件下14 000 r/min低溫離心15 min，取上清液，用Millipore 0.22 μm針頭式過濾器過濾，放入自動進樣器中待測。神經(jīng)遞質(zhì)含量按ng/g組織重量計算。

1.5.4.2 色譜條件 預(yù)柱：ESA HR-80，4.6 cm×8 cm；色譜柱：ESA MD-150(3.2 mm×150 mm)；流動相：90 mmol/L 磷酸二氫鈉， 1.7 mmol/L 1-辛烷磺酸鈉，50 mmol/L 檸檬酸，50 μmol/L EDTA，10% 乙腈，pH 約為3.00。流速：0.6 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；設(shè)置4道電勢分別為：-150 mV、200 mV、350 mV、500 mV。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)變化 模型組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯下降，糞便粒數(shù)增多，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，中央格停留時間有上升趨勢；而治療組大鼠水平運動得分、垂直運動得分均高于模型組，糞便粒數(shù)減少，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，中央格停留時間有減少趨勢。造模前組間比較無差異；造模21 d后，與對照組相比，模型組大鼠蔗糖水偏好值明顯下降(P<0.01)；而治療組大鼠蔗糖水偏好值高于模型組(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組開野實驗、蔗糖水實驗結(jié)果(±s)

2.2 海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化

2.2.1 海馬單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化 模型組海馬中5-HT、5-HIAA與DA含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，NE與對照組相比呈增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療組與對照組海馬中5-HT、5-HIAA、DA、NE含量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療組與模型組相比，5-HT、5-HIAA與DA含量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，NE含量呈減少趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、圖1。

表2 各組海馬5-HT、5-HIAA、DA、NE含量比較(±s) ng/g

圖1 實驗大鼠海馬樣本5-HT、5-HIAA、DA、NE色譜圖

2.2.2 下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量變化 模型組下丘腦中5-HT、5-HIAA與DA含量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NE與對照組相比呈增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療組與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療組與模型組相比，5-HT與DA含量均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，5-HIAA含量呈增加趨勢，NE含量呈減少趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3、圖2。

圖2 實驗大鼠下丘腦樣本5-HT、5-HIAA、DA、NE色譜圖

3 討 論

研究認為肝氣郁結(jié)證(肝郁證)是在壓抑、焦慮、悲痛等負性情緒心理應(yīng)激狀態(tài)下，以高級神經(jīng)中樞調(diào)節(jié)機制紊亂為前提，對神經(jīng)、內(nèi)分泌、循環(huán)、消化、免疫、感覺、運動等多系統(tǒng)病理改變、病證表現(xiàn)的概括[6]。柴胡疏肝散出自《景岳全書》，原方用于“治胸脅疼痛，寒熱往來”，是臨床治療肝氣郁結(jié)證的古典名方。由柴胡、陳皮、川芎、香附、枳殼、芍藥、炙甘草七味中藥組成，具有疏肝解郁，行氣止痛之功效。本實驗用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)法成功建立了肝郁證大鼠模型，其行為學(xué)表現(xiàn)主要是情緒低落、興趣減退、活動度降低、探究行為減少以及體重增加緩慢、攝食量減少、大便異常等。慢性制動是研究心理應(yīng)激的一個較為可靠的方法，特別是用于研究中醫(yī)所述的“郁怒傷肝，肝失疏泄”的病理改變[7]。模型組大鼠水平運動、垂直運動得分明顯下降，提示其活動度及好奇程度均下降，而柴胡疏肝散可改善其變化。蔗糖水偏好值下降與快感缺乏密切相關(guān)。模型組大鼠蔗糖水偏好程度下降，提示其對美味食物(蔗糖水)快感缺乏，而柴胡疏肝散組未見快感缺乏。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的一類神經(jīng)遞質(zhì)，包括5-HT、DA、NE、腎上腺素(A)、組胺等。其中，5-HT、DA與NE有著非常重要的生理功能，三者相互影響，其作用十分廣泛，主要與精神活動、行為及情緒等密切相關(guān)，對哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)功能、內(nèi)臟功能及應(yīng)激反應(yīng)，尤其是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制起著協(xié)調(diào)作用[8]。單胺類信號擾動可以改變成年人的行為：在出生后早期，5-HT敏感期，單胺類信號擾動可影響焦慮和抑郁癥相關(guān)的行為；在圍青春期，5-HT和DA敏感期，單胺類信號擾動可改變攻擊性[9]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在非典型抑郁癥和抑郁癥的亞型中有不同的影響[10]。

5-HT是一種抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，參與對情感、睡眠、警覺、食欲、記憶等多種生理功能的調(diào)節(jié)，還可對體溫、鎮(zhèn)痛及心血管功能產(chǎn)生影響，作用的不同可能與其釋放后結(jié)合的受體不同相關(guān)。功能失調(diào)性5-HT的節(jié)律可能是抑郁癥的一種常見的端點和生物標志物[10]。目前認為在應(yīng)激狀態(tài)下動物腦內(nèi)可出現(xiàn)5-HT更新加速的現(xiàn)象；而在腦內(nèi)的5-HT活性降低時，機體對各種應(yīng)激刺激的敏感性則會增加，從而易受傷害以致引起多種精神癥狀。Azmitia等[11]認為，在應(yīng)激狀態(tài)下下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)(HPA)軸功能亢進，增高的糖皮質(zhì)激素則通過誘導(dǎo)肝臟中的色氨酸吡咯化酶，降解血漿中的色氨酸，從而調(diào)整中樞的色氨酸不足及5-HT合成低下。當5-HT功能過度低下時，HPA軸過度亢進，糖皮質(zhì)激素的升高會造成大腦的損傷，進而導(dǎo)致了情緒低落、興趣減退等抑郁癥狀的發(fā)生；同樣，當HPA軸功能不足時，也會導(dǎo)致5-HT的功能低下。大量研究表明NE與情志活動有密切關(guān)系，NE不但可以作為肝郁證動物模型的反證指標之一，而且也是探討肝郁導(dǎo)致精神情志異常的機理的主要指標之一。當NE系統(tǒng)功能紊亂時，對應(yīng)激適應(yīng)的失敗則可導(dǎo)致焦慮和抑郁癥狀[12]。魯明等[13]用夾鼠尾法建立肝郁證大鼠模型，檢測正常組、模型組及柴胡疏肝散治療組的大鼠腦干NE的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦干的NE含量明顯升高。DA既是NE的前體，又是一種重要的獨立神經(jīng)遞質(zhì)。中腦DA能神經(jīng)元對軀體運動有調(diào)節(jié)作用，對垂體內(nèi)分泌功能和心血管功能有一定調(diào)節(jié)作用，還參與神經(jīng)活動的調(diào)節(jié)，尤其是中腦邊緣皮質(zhì)DA系統(tǒng)在情緒和精神活動中發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果表明：模型組大鼠的行為學(xué)發(fā)生了明顯變化，海馬及下丘腦中的5-HT、5-HIAA、DA含量均下降，NE含量呈增加趨勢，而柴胡疏肝散能調(diào)控肝郁證大鼠腦5-HT、5-HIAA、NE、DA變化趨勢，從而有效發(fā)揮抗肝郁作用。以上實驗結(jié)果說明，肝郁證模型大鼠海馬及下丘腦的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、5-HIAA、DA、NE，與對照組、治療組相比呈現(xiàn)出不同的變化特點，說明肝的疏泄功能與5-HT、5-HIAA、DA及NE有關(guān)；柴胡疏肝散抗肝郁作用可能與調(diào)控5-HT、5-HIAA、DA及NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有關(guān)。

綜上所述，柴胡疏肝散能有效改善肝郁證模型大鼠的行為學(xué)變化，對其海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)有調(diào)控作用。柴胡疏肝散等中藥復(fù)方治療情志類疾病臨床療效顯著，但其作用機制尚未明確，并不局限于對單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控，值得進一步探討。

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(本文編輯郭懷印)

Effects of Chaihu Shugan Power on the Levels of Monoamine Neurotransmitters in the Hippocampus and Hypothalamus in Rats with Liver-qi Stagnation Syndrome

Ma Yufeng,Wang Jialing,Xing Jia,Zhu Xiaochen,Yue Guangxin,Wang Yulai,Guo Rongjuan,He Lijuan

Third Affiliated Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China

He Lijuan (Dongfang Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing,China)

Objective To study the effects of Chaihu Shugan powder (CSD) on the ethological changes and levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus in rats with liver-qi stagnation syndrome.Methods The rat model with liver-qi stagnation syndrome was established by chronic restraint stress and keeping them alone.Each rat was reviewed by Open-field test,Sucrose test and determined the levels of monoamine neurotransmitters in the hippocampus and hypothalamus by high performance liquid chromatography (HPLC).Results The ethological manifestation of model rats was changed obviously,and the levels of 5-hydroxytryptamine (5-HT), 5-hydroxyindoleacetic acid (5-HIAA),dopamine(DA) in the hippocampus and hypothalamus were decreased,while the level of norepinephrine (NE) was increased.CSD could regulate its trends.Conclusion CSD can improve the model rat’s ethological manifestation and have therapeutic effects of liver-qi stagnation syndrome.The mechanism may be adjust the levels of 5-HT,5-HIAA,NE,DA in rat brain with liver-qi stagnation syndrome,in order to effectively play the role of anti-liver-qi stagnation.

liver-qi stagnation syndrome;Chaihu Shugan power; monoamine neurotransmitters; 5-hydroxytryptamine; 5-hydroxyindoleacetic acid;dopamine

國家自然科學(xué)基金資助項目(No.30973706)；賀立娟青年教師專項(No.2013-QNJSZX016)

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(北京 100029)；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院；3.中國中醫(yī)科學(xué)院

賀立娟，E-mail：ljhebj@126.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.21.008

1672-1349(2016)21-2494-04

2016-07-21)

引用信息：馬玉峰，王嘉麟，邢佳，等.柴胡疏肝散對肝氣郁結(jié)證大鼠海馬及下丘腦單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2016，14(21)：2494-2497.