煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的生物信息分析

李炳澤，王德勛，徐成龍，蘇家恩*

(1.大理州煙草公司鶴慶縣分公司，云南鶴慶 672100；2.云南省煙草公司大理州公司，云南大理 671000：3.大理州煙草公司祥云縣分公司，云南祥云 672100)

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煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的生物信息分析

李炳澤1，王德勛2，徐成龍3，蘇家恩2*

(1.大理州煙草公司鶴慶縣分公司，云南鶴慶 672100；2.云南省煙草公司大理州公司，云南大理 671000：3.大理州煙草公司祥云縣分公司，云南祥云 672100)

[目的]探討煙草在采收前的生理期和烘烤過(guò)程中的變黃階段抗逆機(jī)制。[方法]利用生物信息學(xué)方法對(duì)煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的理化特性、信號(hào)肽、跨膜、系統(tǒng)進(jìn)化和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析。[結(jié)果]煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4為堿性、水溶性、耐高溫和非分泌型的游離蛋白，該蛋白為葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，僅剪切修復(fù)后才具有活性，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)。[結(jié)論]通過(guò)煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4研究，為煙草抗逆境脅迫研究提供理論基礎(chǔ)。

生物信息；轉(zhuǎn)錄因子；bZIP；煙草

煙草是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物，種植面積達(dá)100多萬(wàn)hm2，年產(chǎn)量200多萬(wàn)t[1]。受生育期生態(tài)條件的影響，不同年份煙草在大田中的生長(zhǎng)發(fā)育、烤后煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)存在差異。煙草具有可塑造性強(qiáng)、適應(yīng)性廣等特性[2]，在逆境脅迫中，煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4在植物生長(zhǎng)發(fā)育、質(zhì)的形成和量的積累中擔(dān)當(dāng)重要角色，主要通過(guò)改善細(xì)胞的通透性、調(diào)節(jié)氧化酶和還原酶的活性和防止核酸類物質(zhì)降解，進(jìn)而增加煙草的適應(yīng)性，保證"兩煙"品質(zhì)的穩(wěn)定[3]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是含有一個(gè)二聚體結(jié)構(gòu)域的亮氨酸拉鏈和核酸鏈的結(jié)構(gòu)域組成的pH>7的亮氨酸拉鏈蛋白[4]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于植物中，尤其在煙草中含有4類ZIP轉(zhuǎn)錄因子，分別為BZI-1、BZI-2、BZI-3、BZI-4[5-6]。bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4能夠參與煙草植株對(duì)病毒和菌害的抵抗、煙草的光信號(hào)和外界各種環(huán)境的逆境脅迫。筆者研究煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4在逆境條件下的作用機(jī)理，以期為煙草抗逆機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 通過(guò)NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4核酸序列、蛋白序列和編碼序列，其登錄號(hào)分別為AY045572、AAK92215和AY045572。

1.2 方法

1.2.1 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的理化特性分析。通過(guò)ExPASy的Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)在線工具獲得煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的氨基酸組成、原子總數(shù)、總平均親水性、理論等電點(diǎn)、分子式、脂肪指數(shù)、正/負(fù)電荷殘基總數(shù)、不穩(wěn)定指數(shù)、分子質(zhì)量和氨基酸數(shù)[7]。

1.2.2 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的信號(hào)肽和跨膜分析。利用MITOPROT(https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)對(duì)煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)[8]；利用TMpred的統(tǒng)計(jì)分析方法，通過(guò)TMpred(http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)的多序列比對(duì)方法進(jìn)行跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)，最小值的參數(shù)為17，最大值的參數(shù)為33。

1.2.3 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的亞細(xì)胞定位。采用TargetP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/SubLoc)[9]，其Organism group選Plant，Prediction scope采用Perform cleavage site predictions，Cutoffs選用specificity >0.90(predefined set of cutoffs that yielded this specificity on the TargetP test sets)，通過(guò)以上參數(shù)對(duì)煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

1.2.4 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子在NCBI中BLAST，獲得菜豆(Phasedusvulgaris)、碧桃(Prunuspersica)、玉米(Zeamays)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)和大豆(Glycinemax)相應(yīng)bZIP轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列，其登錄號(hào)分別為AAK25822、AEL13842、NP_001140593、NP_181594、NP_176108和NP_001235209。通過(guò)ClustalW 2對(duì)多序列進(jìn)行比對(duì)[10]，獲得比對(duì)文件，并以Clustal的格式儲(chǔ)存。采用PhyML 3.0在線工具，對(duì)多序列文件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，其參數(shù)Statistical tests for branch support采用Approximate Likelihood-Ratio Test(aLRT)，Number of substitution rate categories的參數(shù)為4，Gamma distribution parameter選擇estimated參數(shù)為1，Proportion of invariable sites選擇estimated參數(shù)為0，Transition / transversion ratio(nucleic acids only)選擇estimated參數(shù)為1，獲得進(jìn)化樹(shù)文件。運(yùn)用TreeDyn工具對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行查看和編輯[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的理化特性 通過(guò)在線工具分析bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的理化特性，結(jié)果表明，bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4因子的原子總數(shù)為2 208 Da，總平均親水性為-0.678，理論等電點(diǎn)為9.76，分子式為C667H1118N206O210S7，脂肪指數(shù)為82.10，正/負(fù)電荷殘基總數(shù)分別為17和24，不穩(wěn)定指數(shù)為59.54，分子質(zhì)量為15 607.8，氨基酸數(shù)為138，含量最多的3種氨基酸分別為丙氨酸(Ala)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)。表明煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4為堿性水溶性蛋白；因不穩(wěn)定指數(shù)>40，該轉(zhuǎn)錄因子為相對(duì)穩(wěn)定的高耐熱性蛋白；因負(fù)電荷殘基總數(shù)少，轉(zhuǎn)錄因子為帶正電的蛋白。綜合分析，煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4對(duì)煙葉水分含量敏感，且在逆境條件下不易損傷。因此，該轉(zhuǎn)錄因子能夠在烘烤過(guò)程中的變黃階段發(fā)揮作用。

2.2 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的信號(hào)肽和跨膜分析 由圖1可知，信號(hào)肽的分值(S score)、剪切位點(diǎn)的分值(C score)和綜合剪切位點(diǎn)的分值(Y score)有不同程度的波動(dòng)，但均小于0.5，因此該轉(zhuǎn)錄因子不具有信號(hào)肽，不屬于分泌蛋白，說(shuō)明煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4存在于特定的亞細(xì)胞部位發(fā)揮作用。由圖2可知，煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4各階段的TMpred信號(hào)均小于500，因此該轉(zhuǎn)錄因子不具有跨膜結(jié)構(gòu)，為游離蛋白。這表明煙草在受到生理期或烘烤過(guò)程中逆境脅迫時(shí)，bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4能快速激活或抑制下一階段的反應(yīng)，表現(xiàn)出抗性作用。

2.3 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的亞細(xì)胞定位 由表2可知，BZI-4的序列長(zhǎng)為138，其中所占概率最大的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽概率(cTP)為0.662，線粒體導(dǎo)肽概率(mTP)為0.139，其他類型的分值概率為0.349，這表明煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4可能為存在于葉綠體中的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，不利于葉綠體在調(diào)制過(guò)程變黃階段的降解。對(duì)煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的剪切位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的第39位存在剪切位點(diǎn)，表明該轉(zhuǎn)錄因子屬于修飾蛋白，煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4在未修飾前，以穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)存在于葉綠體中，當(dāng)外界條件發(fā)生變化時(shí)，煙草為快速適應(yīng)環(huán)境，通過(guò)剪切已存在煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的1～39位殘基氨基酸，使其活性位點(diǎn)暴露，致使bZIP轉(zhuǎn)錄因子在葉綠體中產(chǎn)生活性，從而在采前生理期及烤中變黃期等逆境條件下快速發(fā)揮抗逆作用。

圖1 bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.1 Signal peptide prediction of bZIP transcription factor BZI-4

注：i為膜內(nèi)，o為膜外。Note：i was in the membrane，and o was outside the membrane.圖2 bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Prediction of transmembrane structure of bZIP transcription factor BZI-4

2.4 煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的系統(tǒng)進(jìn)化分析 以菜豆、碧桃、玉米、擬南芥和大豆bZIP轉(zhuǎn)錄因子為參考對(duì)象，使用Clustalx2和PhyML 3.0對(duì)菜豆、碧桃、玉米、擬南芥和大豆氨基酸殘基序列進(jìn)行多重比較，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)。根據(jù)氨基酸殘基的進(jìn)化程度和同源性關(guān)系，將其分為3個(gè)亞組，其中煙草處于第二亞組。在整體進(jìn)化關(guān)系中，煙草和碧桃的親緣關(guān)系較近，抗性方面的功能更加相近，反映了2個(gè)物種抗性功能在一定范圍內(nèi)可以相互借鑒。

表2 bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的亞細(xì)胞定位

注：Ph為菜豆，Gl為大豆，Pr為碧桃，To為煙草，Ar為擬南芥，Ze為玉米。Note：Ph stand for Phasedus vulgaris, Gl stand for Glycine max, Pr stand for Prunus persica, To stand for Tobacco, Ar stand for Arabidopsis thaliana, Ze stand for Zea mays.圖3 bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of bZIP transcription factor BZI-4

3 結(jié)論與討論

該研究結(jié)果表明，煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4在采前生理期及烘烤過(guò)程中的變黃階段等逆境條件下發(fā)揮作用，對(duì)逆境環(huán)境反映迅速，從而使煙草快速適應(yīng)逆境環(huán)境。煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4抵抗逆境的范圍廣，能夠參與煙草植株對(duì)病毒和菌害的抵抗、煙草的光信號(hào)[12]、煙草植株的生長(zhǎng)發(fā)育、煙草種子的成熟、煙株在溫度過(guò)度變化等外界各種不利逆境脅迫的抵抗[13]。煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子BZI-4具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，在逆境脅迫前已存在葉綠體中，但無(wú)活性，在逆境脅迫的條件下激活修飾蛋白對(duì)其進(jìn)行剪切修飾，使其發(fā)揮作用。

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Biological Information Analysis of bZIP Transcription Factor BZI-4 in Tobacco

LI Bing-ze1, WANG De-xun2, XU Cheng-long3, SU Jia-en2*

(1. Heqing County Branch of Dali Prefecture Tobacco Company, Heqing, Yunnan 672100; 2. Dali Prefecture Company, Yunnan Tobacco Company, Dali, Yunnan 671000; 3. Xiangyun County Branch of Dali Prefecture Tobacco Company, Xiangyun, Yunnan 672100)

[Objective] To discuss the related factors of resistance to stress in the physiological period of tobacco before harvesting and baking yellowing stage. [Method] The physical and chemical properties, signal peptide, transmembrane, system evolution and subcellular localization of tobacco bZIP transcription factor BZI-4 were analyzed by bioinformatics methods. [Result] Tobacco bZIP transcription factor bzi-4 was alkaline water solubility and relative stability, high heat resistance, non-secretion type of free protein. The protein might be existed in chloroplast transit peptide, its activity must be exerted through the amino acid sequence of shear, and the condition of adaptive evolution was moderate. [Conclusion] The study of bZIP transcription factor BZI-4 in tobacco provides a theoretical basis for the study of tobacco resistance to stress.

Biological information; Transcription factor; bZIP; Tobacco

云南省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目“提高紅花大金元品種煙葉可用性配套烘烤技術(shù)研究”(2013YN29)。

李炳澤(1969- )，男，云南鶴慶人，助理農(nóng)藝師，從事煙葉生產(chǎn)技術(shù)指導(dǎo)工作。*通訊作者，高級(jí)農(nóng)藝師，從事烘烤技術(shù)研究及推廣工作。

2016-08-31

S 188

A

0517-6611(2016)31-0156-02