小葉樸組織培養無菌體系的建立

王斯彤

(遼寧省固沙造林研究所，遼寧阜新 123000)

?

小葉樸組織培養無菌體系的建立

王斯彤

(遼寧省固沙造林研究所，遼寧阜新 123000)

[目的]建立小葉樸組織培養初代無菌體系。[方法]通過對不同消毒劑及消毒時間的對比，篩選出能夠有效控制小葉樸初代培養的污染率，且不抑制小葉樸莖段萌發的消毒處理。[結果]小葉樸莖段經70%乙醇消毒30 s 2次，再用氯化汞消毒6 min所得莖段污染率低，萌發率高。對于后期出現的真菌污染采用多菌靈作為消毒劑和添加劑，用200 mg/L多菌靈浸泡外植體60 min能有效地控制污染，且具有較高的萌發率。在培養基中添加200 mg/L多菌靈也能抑制真菌污染，且效果優于多菌靈浸泡處理。[結論]建立了小葉樸組織培養無菌體系，為小葉樸組培苗的增殖和生根提供參考。

小葉樸；消毒處理；組織培養

小葉樸(Celtisbungenana)為榆科樸屬落葉喬木，其樹形端正，遮陰好，是常用的庭院綠化及行道樹種，也可以利用其鄉土樹種的優勢，進行荒山造林。由于小葉樸生長緩慢，主要繁殖方式是播種繁殖，繁殖時間長，極大地制約了小葉樸在林業上的推廣應用。將組織培養技術應用于小葉樸的繁殖上，不僅可以縮短繁育年限，同時對小葉樸的良種選育起到促進作用。污染是小葉樸組織培養過程中的技術難題。外植體材料、培養基、接種工具、接種室消毒不嚴格或無菌操作不規范及植物內生菌的存在等因素均可導致污染的發生。乙醇、氯化汞等消毒試劑的使用能夠很好地消滅莖段表面的細菌，但對于植物莖段內的內生菌及真菌難以消除。筆者采用多菌靈作為消除內生菌和真菌的藥劑，采用消毒劑和添加劑2種形式進行對比，建立初代無菌體系，為小葉樸組培苗的增殖和生根提供參考[1-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試材料采自沈陽農業大學后山的小葉樸，枝條應在連續3個晴天后采集，采集當天天氣晴朗，時間在11：00～15：00，選取小葉樸當年萌發的幼嫩莖段作為外植體進行消毒對比試驗。消毒試劑：乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、青霉素、多菌靈。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的預處理。選取生長良好、無病蟲害的小葉樸新萌發枝條，將枝條剪成長約5 cm帶腋芽或頂芽的小段，去除葉片，加少量洗衣粉清洗表面的雜質，用流水沖洗30～60 min后，再用蒸餾水沖洗4～5次(不斷振蕩燒杯)，置于超凈工作臺上備用。

1.2.2 外值體的消毒。①乙醇(70%、75%)、氯化汞(0.1%)配合使用進行消毒，消毒后無菌水沖洗3～4次，接種至培養基中。②使用次氯酸鈉(2%)消毒6、9、12、15 min，消毒后無菌水沖洗3～4次，接種至培養基中。③使用多菌靈(3%)溶液浸泡消毒20、40、60 min，消毒后無菌水沖洗3～4次，再用乙醇和氯化汞配合消毒，接種至培養基后進行觀察。與多菌靈作為添加劑進行對真菌抑制對比。

1.2.3 培養基中消毒劑的添加。在配制培養基過程中，加入瓊脂、植物生長調節劑和蔗糖后，在各組培養基中分別單獨加入不同濃度的青霉素和多菌靈，青霉素濃度為25、50、100、200 mg/L ，多菌靈(50%)為25、50、100、200 mg/L。

1.3 數據分析 采用隨機區組設計，通過腋芽萌發率、污染率等指標，研究消毒劑和消毒時間對污染率和萌發率的影響。計算公式：

萌發率=萌發的莖段數/外植體數×100%

污染率=污染的莖段數/外植體數×100%

2 結果與分析

2.1 不同乙醇與氯化汞配合處理對外植體的影響 由表1可知，乙醇與氯化汞配合使用能有效地控制污染率，促進莖段萌發。隨著乙醇和氯化汞消毒時間的增加，污染率逐漸降低，但消毒時間過長會抑制莖段的萌發，降低莖段的萌發率。綜合考慮，處理⑤污染率偏低，萌發率較高，為小葉樸較好的消毒處理。

方差分析結果表明，乙醇對小葉樸莖段的預處理具有顯著影響，乙醇具有較強的穿透性，利用此特性，可以清除小葉樸莖段表面細菌，同時加強了氯化汞的消毒效果。2.2 不同次氯酸鈉消毒時間對外植體的影響 用2%次氯酸鈉對小葉樸莖段進行不同時間的消毒處理，其污染率及萌發率見表2。由表2可知，隨著消毒時間的增加，污染率逐漸降低，當消毒時間達15 min時污染率降低不明顯，且會抑制莖段萌發。因此，最適消毒時間為12 min，此時污染率和萌發率都控制在較適宜的范圍。

表1 乙醇和氯化汞對小葉樸莖段的消毒效果

Table 1 Disinfection effect of Alcohol and mercuric chloride to Celtis bungenana

處理Treat-ment滅菌時間Thesterilizationtime乙醇Alcohol氯化汞mercuricchloridemin污染率Pollutionrate∥%萌發率Germinationrate∥%①70%30s1次355.133.7②70%30s1次638.744.5③70%30s1次936.645.9④70%30s2次349.737.9⑤70%30s2次634.549.1⑥70%30s2次933.347.8⑦75%30s1次355.834.7⑧75%30s1次637.942.3⑨75%30s1次932.539.8⑩75%30s2次347.332.575%30s2次633.142.775%30s2次932.738.6

注：樣本數為60。

Note：Samle number was 60.

表2 2%次氯酸鈉對小葉樸莖段的消毒效果

Table 2 Disinfection effect of 2% sodium hypochlorite toCeltisbungenana

處理Treatment滅菌時間Thesterilizationtime∥min污染率Pollutionrate∥%萌發率Germinationrate∥%①655.839.4②943.942.2③1239.745.3④1538.141.9

2.3 多菌靈對外植體真菌污染的抑制作用 由圖1可知，多菌靈作為消毒劑和添加劑均能降低污染率。隨著多菌靈濃度的升高，污染率降低，多菌靈濃度從50 mg/L升至100 mg/L時污染率降低最明顯，當多菌靈濃度為100～200 mg/L時，污染率降低趨于平緩。而多菌靈作為添加劑的消毒效果優于消毒劑，其原因為多菌靈作為添加劑加入培養基中，能夠參與其新陳代謝，進入植物體內起到殺菌消毒的作用。而作為消毒劑時，消毒劑的濃度和消毒時間都會影響消毒效果。由圖2可知，隨著消毒時間的增加，污染率降低，消毒時間在60～80 min時趨于平緩，污染率變化較小，且萌發率有所下降，說明當消毒時間達80 min時，污染率降低不明顯，但會抑制莖段的萌發。

圖1 多菌靈作為消毒液和添加劑對真菌污染的影響Fig.1 Effect of Carbendazim as disinfectant and additive on fungi pollution

圖2 不同消毒時間對污染率和萌發率的影響Fig.2 Effect of Different disinfection time on pollution rate and germination rate

2.4 添加劑的消毒效果 通過在培養基中添加青霉素和多菌靈，對比2種消毒劑的消毒效果，結果見圖3。由圖3可知，青霉素對細菌污染的發生有一定的抑制作用，特別是前10 d，效果明顯，但對真菌污染作用不明顯。多菌靈對細菌污染的抑制效果一般，但對后期真菌污染有較好的效果，這與李穎等[6]研究結果一致。

圖3 添加劑的消毒效果Fig.3 Additive effect of disinfection

3 結論與討論

小葉樸莖段具有污染率高、消毒困難的問題，需要進行多種消毒試劑以及消毒時間的篩選。消毒時間過長影響萌發率，過短則消毒不徹底，易污染。該試驗對小葉樸莖段進行消毒篩選，結果表明，經70%乙醇消毒30 s 2次，再用氯化汞消毒6 min所得莖段污染率低，萌發率高。在用2%次氯酸鈉進行消毒試驗中，次氯酸鈉對小葉樸莖段的消毒效果較好，用2%次氯酸鈉浸泡12 min時，消毒效果好，萌發率高，但與乙醇和氯化汞配合使用相比略有不足。因此，生產實踐中，追求較低的污染率和較高的萌芽率時可采用乙醇與氯化汞。

針對出現的真菌污染，該研究采用的多菌靈效果突出，分別作為消毒劑和添加劑加入到培養基中，發現其抗污染能力強，對外植體的副作用小，且萌發率高。而作為消毒劑時，長時間的浸泡會刺激植物表皮，影響莖段萌發。

在青霉素和多菌靈作為添加劑的對比試驗中，青霉素能夠較好地控制細菌污染，多菌靈能夠控制真菌污染，且萌發率高，因此，可嘗試青霉素和多菌靈混合使用，以減少污染。多菌靈和青霉素對小葉樸莖段的生長發育是否有影響鮮見報道，因此需要后續試驗進行規范和調整，以建立小葉樸組織培養的完整體系。

[1] 王繼飛，胡天華，朱莉華.寧夏賀蘭山珍稀瀕危植物小葉樸資源現狀及保護對策[J].寧夏農林科技，2012，53(6)：103-104.

[2] 彭廣霖，李青，衣淑玉，等.次氯酸鈉防治組培苗污染的研究[J].安徽農業科學，2012，40( 16)：8806-8808.

[3] 劉紹雄，王娟，王明月，等.巨龍竹組培苗污染優勢內生菌的分離與鑒定[J].南方農業學報，2013，44(3)：416-421.

[4] 彭廣霖，于詠梅，薛元霞，等.氯化汞防治組培苗污染的研究[J].北方園藝，2012(15)：131-133.

[5] 方麗，汪一婷，呂永平，等.植物組培產業化生產中污染防控技術研究[J].浙江農業學報，2012，24(6)：1074-1078.

[6] 李穎，李春燕.多菌靈和青霉素在組培污染中的應用[J].林業科技，2012，27(1)：6-8.

The Establishment of Tissue Culture Sterile System ofCeltisbungenana

WANG Si-tong

(Sand-fixation Afforestation Institute in Liaoning Province,Fuxin,Liaoning 123000)

[Objective] The aim was to establish tissue culture sterile system ofCeltisbungenana. [Method]Through the comparison of different disinfectants and disinfection time, tissue culture sterile system ofCeltisbungenanawith lowerpollution rate and higher germination rate were screened. [Result]By comparison with 70% alcohol disinfection 30 s 2 times, with mercuric chloride for 6 minutes from the stem segments were of low pollution, high germination rate.Late for the fungus pollution using carbendazim as disinfectant and additives, soaking with 200 mg/L carbendazim explant 60 min, can effectively control the pollution, and can have better germination rate. 200 mg/L is added in the culture medium carbendazim can restrain fungus contamination, and better than carbendazol soaking process. [Conclusion] The study stablihed tissue culture sterile system ofCeltisbungenana, and provide reference for proliferation and rooting ofCeltisbungenana.

Celtisbungenana; Disinfection treatment; Tissue culture

王斯彤(1990- )，女，遼寧阜新人，助理工程師，從事林木遺傳育種研究。

2016-08-24

S 723

A

0517-6611(2016)31-0153-03