脫毒菜籽多肽對小鼠免疫功能的影響

黃姍芬，李云亮，楊 雪，王禹程，馬海樂

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013)

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脫毒菜籽多肽對小鼠免疫功能的影響

黃姍芬，李云亮，楊 雪，王禹程，馬海樂*

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江 212013)

[目的]研究脫毒菜籽多肽對小鼠免疫功能的影響。[方法]試驗組以低、中、高劑量組0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)的脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，對照組以等體積純凈水灌胃，30 d后進行二硝基氟苯誘導小鼠遲發性變態反應試驗、ConA 誘導小鼠脾淋巴細胞轉化試驗、抗體生成細胞檢測和血清溶血素測定試驗、小鼠碳廓清試驗、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、NK細胞活性測定試驗、試驗前后小鼠體重以及臟器/體重比值試驗。[結果]脫毒菜籽多肽對小鼠的耳廓腫脹、脾淋巴細胞轉化、吞噬指數a和NK細胞活性均有顯著影響，但對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、脾抗體生成細胞量、血清溶血素水平和腹腔巨噬細胞吞噬能力均無影響。[結論]脫毒菜籽多肽具有增強免疫力的功能。

脫毒菜籽；多肽；鼠；免疫功能；影響

我國的油菜籽資源豐富，產量位居世界第一，油菜籽年產量高達1 300萬t以上。菜籽粕是油菜籽經榨油后剩下的副產物，菜籽粕中蛋白含量高達35%～45%[1]，氨基酸含量豐富且組成較均衡，營養價值較高，但菜籽粕中含有大量的硫苷、芥酸等有毒有害物質，極大地限制其利用程度。目前大多先對菜籽粕進行脫毒處理[2]，經脫毒后的菜籽粕，無論是生物效價還是利用率均很高，是一種非常優質的植物蛋白資源。近年來，為促進脫毒菜籽蛋白高值化利用，采用酶解法制備菜籽功能性多肽已成為研究熱點問題之一[3-6]。大量研究表明，菜籽多肽具有降血壓[7-11]、抗氧化[12-16]、抗腫瘤[17-18]、提高免疫力[19]等功效。

免疫力是人體的防御機制，是人體抵抗外來疾病的關卡。人體通過免疫系統識別自身和異己物質，并破壞和排斥異己的物質，以維持健康。人體免疫力低下，容易感染細菌、病毒和真菌，導致患病。免疫力低下的癥狀通常不易被人們察覺，但它卻會嚴重威脅人體健康。目前對于菜籽多肽增強免疫功能的研究較少[20]，且大多數文獻關于菜籽多肽對免疫功能影響的研究不透徹[18，21]。筆者以脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，研究試驗前后動物體重、臟器/體重比值、細胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫，探索菜籽多肽對小鼠免疫功能的影響，為菜籽多肽高值化應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品與試劑。脫毒菜籽多肽購自江蘇天琦生物科技有限公司，多肽含量≥85%。小牛血清、刀豆蛋白A(ConA)、四氮唑藍(MTT)、2-硫基乙醇(2-ME)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)均購自Sigma試劑公司。綿羊紅細胞(SRBC)購自北京百奧萊博科技有限公司。RPMI1640細胞培養基購自上海浩然生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備。MSS全波長酶標儀，美國熱電·芬蘭雷勃(Thermo Labsystems Co)；SPX-250B生化培養箱，常州國華電器有限公司。

1.1.3 試驗動物及設施。選用上海斯萊克實驗動物有限公司提供的18.0～22.0 g健康雌性清潔級ICR小鼠[動物生產許可證號：SCXK(滬)2012-0002號]。全部動物均給予滅菌鼠飼料和滅菌水自由取用。

1.2 試驗方法

1.2.1 受試物和脫毒菜籽多肽劑量設計。

1.2.1.1 動物分組試驗。分批按體重隨機分為4組試驗：①二硝基氟苯誘導小鼠遲發性變態反應試驗；②抗體生成細胞檢測和血清溶血素測定試驗；③小鼠碳廓清試驗；④小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。

1.2.1.2 劑量設計。成人(按60 kg體重計)每日推薦攝入量為4 g，相當于0.066 7 g/(kg·d)。試驗按低、中、高設置0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)3個劑量組，分別相當于人體推薦量的5、10和30倍。溶劑對照組以等體積純凈水灌胃。

1.2.1.3 受試物的前處理。稱取樣品3.34、6.67和20.00 g，分別加純凈水至200 mL配制成各組受試液(存放于4 ℃冰箱，每2 d配制1次)。各組小鼠以0.02 g/(kg·d)的灌胃容積，連續經口灌胃30 d后測其各項免疫指標。

1.2.2 體重及臟器指數試驗。

1.2.2.1 體重測定。稱量受試物經灌胃脫毒菜籽多肽前后的體重。

1.2.2.2 臟器指數。參照白玉[22]的方法檢測受試物的臟器/體重比值(胸腺指數和脾指數)。

1.2.3 細胞免疫功能試驗。

1.2.3.1 二硝基氟苯誘導小鼠遲發性變態反應。參照葛飛等[23]的方法略有改動。采用1% DNFB丙酮麻油溶液涂抹受試物耳廓，使其致敏。

1.2.3.2 ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化試驗。采用MTT測定法[22]，略有改動。用于顯色測定受試物脾淋巴細胞的增殖數量。

1.2.4 體液免疫功能試驗。

1.2.4.1 抗體生成細胞檢測。采用Jerne改良載片測定法[24]。通過對小鼠腹腔注射SRBC，刺激其脾細胞產生SRBC抗體，將該脾細胞與SRBC進行溶血空斑試驗，并計算溶血空斑數。

1.2.4.2 血清溶血素測定。采用半數溶血值(HC50)測定法[23]，略有改動，其中以SA緩沖液代替血清設為對照。通過對小鼠腹腔注射SRBC，使其血清產生SRBC抗體，其血清與SRBC發生溶血反應，并釋放血紅蛋白，檢測其半數溶血時的光密度值。

1.2.5 非特異性免疫功能試驗。

1.2.5.1 小鼠碳廓清試驗。參照白玉[22]的方法略有改動，其中印度墨汁∶生理鹽水調整為1∶7(V/V)。在一定濃度范圍內，體內碳顆粒被清除的速率與血碳濃度呈指數函數關系。從小鼠尾靜脈注射墨汁，2和10 min后分別測其血液的光密度值。

1.2.5.2 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。采用滴片法[24]。通過對小鼠腹腔注射SRBC，激活巨噬細胞，取出該細胞后與雞紅細胞反應，經染色后用顯微鏡觀察平均每個巨噬細胞吞噬雞紅細胞的個數。

1.2.5.3 NK細胞活性測定。參照白玉[22]的方法略有改動。其中靶細胞最大釋放孔加2.5% Triton。通過脾細胞懸液與靶細胞反應，釋放乳酸脫氫酶，發生顯色反應，檢測其光密度值。

2 結果與分析

2.1 脫毒菜籽多肽對小鼠體重的影響(表1) 5組免疫試驗結束后，各劑量組小鼠體重均有所增長，但小鼠體重的增長均與溶劑對照組相比無顯著差異(P>0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對小鼠體重的增長無明顯作用。

表1 脫毒菜籽多肽對每組免疫試驗前后小鼠體重的影響

2.2 脫毒菜籽多肽對小鼠臟器/體重比值的影響(表2) 各劑量組小鼠與溶劑對照組相比無顯著差異(P>0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對小鼠的機體免疫器官的增重無明顯作用。

2.3 脫毒菜籽多肽對小鼠耳廓遲發性變態反應的影響 遲發型超敏反應是以單個核細胞浸潤和組織細胞損傷為主要特征的細胞免疫反應[25]。由表3可見，各劑量組小鼠耳廓腫脹程度均高于溶劑對照組，且低、中、高劑量組小鼠耳廓腫脹程度與溶劑對照組相比均有顯著差異(P<0.01，P<0.05)，表明低、中、高劑量脫毒菜籽多肽對小鼠細胞免疫具有增強作用。

2.4 脫毒菜籽多肽對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響 從表4可看出，各劑量組光密度差值均高于溶劑對照組，僅低劑量組小鼠光密度差值與溶劑對照組相比有顯著差異(P<0.01)，表明低劑量脫毒菜籽多肽對小鼠脾淋巴細胞具有增殖作用。

表2 脫毒菜籽多肽對小鼠臟器/體重比值的影響

Table 2 Effect of detoxified rapeseed peptides on viscera/body weight ratio of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只脾臟/體重比值Spleen/bodyweightratio胸腺/體重比值Thymus/bodyweightratio對照組CK1040.86±7.9921.47±6.84低劑量組Lowdosegroup1039.28±5.1920.15±2.95中劑量組Mediumdosegroup1041.35±8.4220.65±2.99高劑量組Highdosegroup1039.08±6.4122.93±4.57

表3 脫毒菜籽多肽對小鼠耳廓遲發性變態反應的影響

Table 3 Effect of detoxified rapeseed peptides onpinna delayed hypersensitivity of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只腫脹度Swellingdegreemg對照組CK1014.84±5.88低劑量組Lowdosegroup1023.41±4.98**中劑量組Mediumdosegroup1019.57±3.63*高劑量組Highdosegroup1019.68±5.61*

注：*、**分別表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：*，* * showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

表4 脫毒菜籽多肽對小鼠脾淋巴細胞增殖能力的影響

Table 4 Effect of detoxified rapeseed peptides on spleen lymphocyte blastogenesis of mouse

組別Group動物數Numberofanimals只光密度值Opticaldensityvalue-ConA+ConA光密度差Opticaldensitydifference對照組CK100.177±0.0270.457±0.1160.280±0.107低劑量組Lowdosegroup100.202±0.0220.630±0.1090.428±0.100**中劑量組Mediumdosegroup100.187±0.0260.532±0.0910.345±0.086高劑量組Highdosegroup100.196±0.0200.545±0.1190.349±0.109

注：**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

Note：** showed extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group.

2.5 脫毒菜籽多肽對小鼠脾抗體生成細胞量的影響 成熟的B細胞定居于脾臟，B細胞在抗原刺激下分化為漿細胞，漿細胞合成和分泌抗體，主要執行機體的體液免疫。由表5可見，各劑量組小鼠的溶血空斑數均高于溶劑對照組，但與對照組相比均無顯著差異(P>0.05)，表明脫毒菜籽多肽對小鼠的體液免疫(抗原直接作用B細胞產生抗體)無促進作用。

表5 脫毒菜籽多肽對小鼠脾抗體生成細胞量的影響

Table 5 Effect of detoxified rapeseed peptides on cells production of antibody of mouse spleen

組別Group動物數Numberofanimals∥只空斑數∥×106脾細胞Plaquenumber∥×106Spleencells對照組CK10423.9±97.8低劑量組Lowdosegroup10498.7±152.3中劑量組Mediumdosegroup10476.3±157.4高劑量組Highdosegroup10496.9±131.2

2.6 脫毒菜籽多肽對小鼠血清溶血素水平的影響 SRBC刺激T細胞的活化增殖，在T細胞的輔助下，B細胞活化分泌抗體[26]。從表6可看出，各劑量組小鼠血清半數溶血值(HC50)與溶劑對照組相比，均無顯著差異(P>0.05)。表明脫毒菜籽多肽對小鼠的體液免疫(抗原作用T細胞，刺激B細胞間接產生抗體)無促進作用。

表6 脫毒菜籽多肽對小鼠血清溶血素水平的影響

Table 6 Effect of detoxified rapeseed peptides on serum hemolysin level of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只HC50對照組CK10165.63±6.06低劑量組Lowdosegroup10167.91±1.89中劑量組Mediumdosegroup10168.02±1.26高劑量組Highdosegroup10166.96±2.09

2.7 脫毒菜籽多肽對小鼠碳廓清的影響 表7顯示，各劑量組小鼠吞噬指數a均高于溶劑對照組，低、中劑量組小鼠的吞噬指數a與溶劑對照組相比有顯著差異(P<0.01，P<0.05)。表明低、中劑量脫毒菜籽多肽對血液中的非特異性免疫具有促進作用。

表7 脫毒菜籽多肽對小鼠碳廓清的影響

Table 7 Effect of detoxified rapeseed peptides on carbon clearance of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只吞噬速率(K值)Phagocyticrate吞噬指數aPhagocyticindexa對照組CK100.0376±0.01245.983±0.612低劑量組Lowdosegroup100.0485±0.01046.830±0.620**中劑量組Medi-umdosegroup100.0331±0.00656.567±0.514*高劑量組Highdosegroup100.0454±0.00796.326±0.527

注：*、**分別表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)。

Note：*，** showed significant differences(P< 0.05)and extremely significant differences(P< 0.01)compared with control group，respectively.

2.8 脫毒菜籽多肽對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響 從表8可以看出，各劑量組小鼠的腹腔巨噬細胞吞噬率及吞噬指數均高于溶劑對照組，但與溶劑對照組相比均無顯著差異(P>0.05)。表明脫毒菜籽多肽對組織液中的非特異性免疫無明顯促進作用。

表8 脫毒菜籽多肽對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

Table 8 Effect of detoxified rapeseed peptides on the function peritoneal macrophage phagocytosis of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只吞噬率Phagocyticrate∥%吞噬指數Phagocyticindex對照組CK1014.0±3.00.184±0.032低劑量組Lowdosegroup1014.5±2.70.185±0.040中劑量組Mediumdosegroup1015.4±2.70.207±0.044高劑量組Highdosegroup1015.8±2.40.204±0.044

2.9 脫毒菜籽多肽對小鼠NK細胞活性的影響 從表9可看出，低劑量組小鼠NK細胞活性最高，且與溶劑對照組有顯著差異(P<0.05)，表明低劑量脫毒菜籽多肽對NK細胞的殺傷活性有促進作用。

表9 脫毒菜籽多肽對小鼠NK細胞活性的影響

Table 9 Effect of detoxified rapeseed peptides on NK cell activity of mouse

組別Group動物數Numberofanimals∥只NK細胞活性NKcellactivity%對照組CK1040.2±5.5低劑量組Lowdosegroup1051.7±13.1*中劑量組Mediumdosegroup1038.5±9.7高劑量組Highdosegroup1041.2±9.9

注：*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。

Note：*showed significant differences(P< 0.05)compared with control group.

3 小結

該研究以脫毒菜籽多肽灌胃小鼠，通過對試驗前后動物體重、臟器/體重比值、細胞免疫功能、體液免疫功能、非特異性免疫的研究，探索菜籽多肽對小鼠免疫功能的影響。結果表明，經口給予0.334、0.667和2.000 g/(kg·d)菜籽多肽，灌胃30 d后，各劑量組菜籽多肽對小鼠體重增長、胸腺/體重比值、脾臟/體重比值、抗體生成細胞數量、血清溶血素水平均無影響，但能顯著提高小鼠脾淋巴細胞的轉化效率、耳廓腫脹程度、單核-巨噬細胞功能和NK細胞活性。根據保健食品增強免疫力功能評價標準，菜籽多肽能有效增強小鼠細胞免疫力。

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Effect of Detoxified Rapeseed Peptides on Mouse Immune Function

HUANG Shan-fen, LI Yun-liang, YANG Xue, MA Hai-le*et al

(School of Food and Biology Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang,Jiangsu 212013)

[Objective] The research aimed to study the effect of detoxified rapeseed peptides on immune function. [Method]Low-, medium- and high-dosage group were fed with 0.334, 0.667 and 2.000 g/(kg·d)detoxified rapeseed peptides, respectively, equal volume of pure water as control group. 30 days later, the following experiments were conducted: DNFB induced mouse delayed type hypersensitivity,mouse spleen lymphocyte transformation capacity induced by ConA,antibody forming spleen cells,serum hemolysin,mouse carbon clearance ability,mouse peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes,NK cell activity,initial and terminal body weight of mice,viscera/body weight ratio.[Result]The detoxified rapeseed peptides on mouse carbon clearance ability, spleen lymphocyte transformation capacity, phagocytic index a and NK cell activity had significant impact. However rapeseed peptides had no significant effect on mouse weight gain, the thymus/body weight ratio, spleen/body weight ratio,cells production of spleen antibody, serum hemolysin leveland function of peritoneal macrophage phagocytosis of chicken erythrocytes.[Conclusion]The detoxified rapeseed peptides have effect on enhancing immunity.

Detoxified rapeseed; Peptides; Mouse; Immune function; Effect

國家863計劃項目(2013AA102203)；江蘇大學高級人才科研啟動基金項目(16JDG049)。

黃姍芬(1992-)，女，湖南郴州人，研究方向：多肽提取及功能評價。*通訊作者，教授，博士，博士生導師，從事功能食品、食品物理學加工方法及裝備的開發研究。

2016-08-31

S 565.4

A

0517-6611(2016)31-0126-03