蜂蜜中磺胺類和氯霉素類同時測定的前處理方法研究

仲光鳳，劉曉玲

(1.山東中質華檢測試驗檢驗有限公司，山東濟寧 272000；2.濟寧市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟寧 272007)

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蜂蜜中磺胺類和氯霉素類同時測定的前處理方法研究

仲光鳳1，劉曉玲2

(1.山東中質華檢測試驗檢驗有限公司，山東濟寧 272000；2.濟寧市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟寧 272007)

[目的]建立同時測定蜂蜜中磺胺類和氯霉素類的超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS)的新方法。[方法]試驗以0.2%的甲酸乙腈作為提取劑，通過一種新型的小柱(Oasis ?PRiME HLB柱)凈化處理，流動相定容過膜后上機待測，可以同時提取出蜂蜜中的磺胺類和氯霉素類。[結果]氯霉素在 0.1 ～ 10.0 ng/mL 范圍內有良好的線性關系，相關系數大于 0.991；磺胺類在0.5～50.0 ng/mL范圍內線性關系良好。氯霉素樣品最低檢出限為 0.1 μg/kg，磺胺類檢出限為0.5 μg/kg，回收率在 82.50%～101.20%，相對標準偏差為 3.2%～4.0%。[結論]該方法快速、準確、靈敏度高，適用于蜂蜜中氯霉素類和磺胺類的檢測。

超高效液相色譜串聯質譜；磺胺類；氯霉素類；蜂蜜

蜂蜜含有豐富的果糖和葡萄糖，易于被人體吸收，同時含有一些人體不可或缺的微量元素，對一些慢性疾病有著很好的療效，得到人們的廣泛喜愛。

獸藥氯霉素類是一種抗生素，主要用于傷寒、副傷寒和其他沙門菌等的防治。蜂農有時會在生病的蜜蜂中噴灑氯霉素類獸藥以縮短養蜂周期和讓病蜂可以持續工作，因此在蜂蜜中會有蓄積。氯霉素會對人體的造血系統產生較大的影響，兒童使用會導致循環衰竭、貧血甚至再生障礙性貧血。近年來，蜂蜜中氯霉素的檢測方法主要有高效液相色譜法[1]、毛細管電泳法[2]、酶聯免疫法[3]、氣相色譜-質譜聯用法[4]和液相色譜-質譜聯用法[5]等。

磺胺類藥物是一種人工合成的抗菌藥物，具有預防和抑制細菌感染性疾病的作用，同時也是動物的生長促進劑，這些藥物進入蜂蜜體內會在其體內蓄積。目前蜂蜜中磺胺類的檢測方法主要有高效液相色譜法[6]、免疫膠體金法[7]、ELISA檢測試劑盒法[8]、薄層色譜法[9]以及高效液相色譜質譜聯用法[10]等。

蜂蜜中同時處理獸藥殘留氯霉素類和磺胺類的方法極少有報道，因此建立一種同時處理這2類藥物殘留的方法非常有必要。筆者將蜂蜜樣品經酸化乙腈提取，Oasis?PRiME HLB固相萃取小柱通過式凈化處理，經超高效液相色譜串聯質譜(UPLC-MS)檢測，對樣品前處理過程和液相、質譜條件進行了優化，建立了蜂蜜中多獸藥殘留同時檢測的方法。

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent 1260-6460超高效液相色譜-質譜聯用儀；超純水機，北京普析，固相萃取儀、氮吹濃縮儀、橫式振蕩器、渦旋混合器，德國 IKA。標準品：氯霉素(chloramphenicol，CAP)、甲砜霉素、氟苯尼考、磺胺多辛、磺胺二甲基噠嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯噠嗪、磺胺甲惡唑、磺胺-6-甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺喹口惡啉，所有標準品購自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的配制。精密稱取適量的氯霉素，以甲醇作為溶劑配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冰箱中避光保存。將上述標準儲備液用甲醇逐級稀釋，配制成10 μg/kg的標準使用液。分別精密稱取適量的16種磺胺標準品，以甲醇作為溶劑配制成1.0 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃冰箱中避光保存。將上述標準儲備液分別逐級稀釋，最終配制成100 μg/kg的磺胺混合標準使用液。

1.2.2 樣品前處理。準確稱取混合均勻的蜂蜜5.0 g(精確至0.001 g)，置于50 mL的離心管中，加入5 mL 水充分溶解，準確加入15 mL 0.2%甲酸乙腈，渦旋提取 30 s，于6 000 r/min離心5 min。將上清液經過無水硫酸鈉于離心管中，殘渣繼續用15 mL 0.2%甲酸乙腈重復提取1次，合并上清液。取上清液準備過 Oasis? PRiME HLB固相萃取柱。取Oasis?PRiME HLB固相萃取小柱，3 mL 80%乙腈清洗活化。將上清液上HLB小柱，保持每秒1滴的流速，收集全部流出液，氮氣下吹干，1 mL流動相定容，過微孔濾膜，上UPLC-MS測試。

1.2.3 UPLC 色譜條件。Agilent超高效液相色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm)；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流速：0.4 mL/min。因為氯霉素為負離子模式，而磺胺為正離子模式。氯霉素類梯度洗脫程序見表1，磺胺類梯度洗脫程序見表2。

表1 氯霉素類梯度洗脫程序

1.2.4 質譜條件。離子源：電噴霧離子源；監測方式：多反應離子監測；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：340 ℃；脫溶劑氣溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔反吹氣流量：50 L/h；質譜條件參數見表 3和表4。

表2 磺胺類梯度洗脫程序

表3 氯霉素類MRM 的分析參數

表4 磺胺類MRM的分析參數

2 結果與分析

2.1 前處理方法的選擇 該試驗中使用不同濃度甲酸酸化的乙腈溶液，按不同比例加入蜂蜜樣品，提取目標化合物。試驗中嘗試了0.2%甲酸和1.0%甲酸2種不同比例的有機酸，同時比較了乙腈和樣品比例分別為3∶1和4∶1提取凈化的效果。結果表明，當采用1.0%甲酸乙腈和樣品比例為4∶1時效果最好，但是1.0%甲酸的添加對磺胺類等堿性化合物回收率影響較大，原因可能是酸性條件下堿性化合物的離子化趨勢增大，在高比例有機相中溶解性減弱。試驗最終選用0.2%甲酸乙腈，4∶1比例加入樣品提取。具體數據見圖1。

圖1 不同提取試劑的回收率Fig.1 Recovery of different extraction reagent

2.2 萃取柱選擇 根據試驗分別對MCX柱、SCX柱、HLB柱以及Oasis?PRiME HLB固相萃取柱進行比較，結果表明，Oasis?PRiME HLB固相萃取柱不僅可以同時洗脫出磺胺類和氯霉素類，而且該柱本身不需要活化，節省了時間，同時各種藥物殘留回收率好，適合蜂蜜中磺胺和氯霉素的同時分析。

2.3 標準工作曲線與檢出限 根據試驗方法測定氯霉素類在0.1～10.0 ng/mL范圍內線性關系良好，而磺胺類在0.5～50.0 ng/mL范圍內線性關系良好。其回歸方程見表5。

表5 磺胺類和氯霉素類線性方程

2.4 色譜圖及保留時間 在試驗選定的色譜條件下，測得8種磺胺類藥物色譜圖(圖2)和3種氯霉素類的色譜圖(圖3)。由圖2、3可知，色譜峰形及其分離度均較好。

圖2 磺胺類色譜Fig.2 Sulfanilamide grous chromatography

圖3 氯霉素類色譜Fig.3 Chloramphenicol chromatography

2.5 回收率和重現性 該試驗通過不同濃度的加標回收在空白試樣中進行2.5、 5.0、 10.0 μg/kg 3個濃度水平的加標回收試驗，每個添加水平重復測定4次，回收率見圖4。并按照同樣方式進行5個批次的試驗，偏差小于3.9%，表明該方法測定結果穩定可靠。

圖4 各項目回收率Fig.4 Recovery of each item

3 結論與討論

該試驗利用0.2%的甲酸乙腈作為提取劑從蜂蜜中同時提取藥物殘留磺胺類和氯霉素類，將提取后的液體經過一種高效的分離柱Oasis? PRiME HLB，該分離柱與以往的SPE柱不同，它是一種通過式的固相萃取方式，將蛋白質、脂肪、磷脂等雜質吸附，將需要提取的物質通過。經過氮吹濃縮、流動相溶解、過膜上機可以同時測定氯霉素類和磺胺類的殘留量。結果表明，在0.1～10.0 μg/L的添加濃度范圍內，磺胺、氯霉素回收率在82.50%～101.20%，精密度RSD<10%(n=5)。該方法簡單快捷，檢出限低，回收率高，重現性好，可以同時測定氯霉素類和磺胺類藥物殘留，可節省時間，適用于蜂蜜中獸藥殘留的檢測需求。

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Study on Pretreatment Method for Simultaneous Determination of Chloramphenicol and Sulfanilamide Grous in Honey

ZHONG Guang-feng1, LIU Xiao-ling2

(1. Shandong Zhong Zhi Hua Jian Test and Inspection Co. Ltd., Jining, Shandong 272000; 2. Jining City Food and Drug Inspection and Testing Center, Jining, Shandong 272007)

[Objective] To establish a new method UPLC-MS for the determination of sulfanilamide grous and chloramphenicols in honey. [Method] With 0.2% formic acid acetonitrile as the extraction agent, through purification treatment by a new column (Oasis? PRiME HLB), sulfanilamide grous and chloramphenicols can be extracted simultaneously. [Result] Chloramphenicol had a good linear relationship in the range of 0.1-10.0 ng/mL, and the correlation coefficient was greater than 0.991; sulfanilamide grous had a good linear relationship in the range of 0.5-50.0 ng/mL. The lowest detection limit of chloramphenicol was 0.1 g/kg, detection limit of sulfanilamide grous was 0.5 μg/kg, recovery was 82.5%-101.2%, relative standard deviation was 3.2%-4.0%. [Conclusion] The method is rapid, accurate and sensitive, and it is suitable for the detection of chloramphenicol and sulfanilamide grous.

UHPLC-MS; Sulfanilamide grous; Chloramphenicols; Honey

仲光鳳(1973- )，女，山東濟寧人，工程師，從事食品中獸藥殘留等的檢測。

2016-08-31

S 896.1;TS 207.3

A

0517-6611(2016)31-0034-03