不同培養基和儲存條件對家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響

王建宇，國 果，楊蔚錦，陶如玉，陳 亞

(1.貴州醫科大學2012級卓越醫師班，貴州貴陽 550004；2.貴州醫科大學基礎醫學院，貴州貴陽 550004)

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不同培養基和儲存條件對家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響

王建宇1，國 果2*，楊蔚錦2，陶如玉2，陳 亞2

(1.貴州醫科大學2012級卓越醫師班，貴州貴陽 550004；2.貴州醫科大學基礎醫學院，貴州貴陽 550004)

[目的] 了解不同培養基和儲存條件對家蠅幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響。 [方法] 分別以豬糞和雞糞為培養基飼養家蠅幼蟲，分別為豬糞處理組和雞糞處理組，用麥麩飼養幼蟲為正常對照組，麥麩中添加大腸桿菌菌液飼養幼蟲為誘導對照組，分別提取各組2齡和3齡家蠅幼蟲的分泌物，使用試劑盒檢測分泌物中溶菌酶含量；分別提取正常對照組和誘導對照組中3齡幼蟲的分泌物，測定在室溫、4 ℃和-20 ℃下不同時間溶菌酶含量的變化。 [結果] 豬糞處理組、雞糞處理組、正常對照組和誘導對照組中分離的3齡幼蟲分泌物中溶菌酶的平均含量分別為2.462、2.782、1.019、2.117 μg/mL，均顯著高于2齡幼蟲(P<0.05)。豬糞處理組、雞糞處理組和誘導對照組2齡和3齡幼蟲分泌物的溶菌酶含量均高于正常對照組(P<0.05)。在室溫下，正常對照組和誘導對照組中溶菌酶的活性均僅能維持14 d左右；在-20 ℃下，溶菌酶的活性均可維持70 d左右；在4 ℃下，正常對照組和誘導對照組中溶菌酶活性的維持時間介于室溫和-20 ℃之間，且2組間溶菌酶含量隨時間的變化規律有一定差異。 [結論] 3齡蠅蛆分泌物中溶菌酶含量高于2齡蠅蛆；雞糞培養基和豬糞培養基能顯著增強家蠅2齡和3齡幼蟲分泌物中溶菌酶含量；在-20 ℃儲存條件下，家蠅溶菌酶可在較長時間內保持較高的活性。

家蠅；溶菌酶；豬糞；雞糞

家蠅幼蟲又稱為五谷蟲，中藥五谷蟲即俗稱的蛆[1]，為麗蠅科(Calliphoridae)昆蟲大頭蠅(ChrysomyiamegacephalaFab.)或其他近緣昆蟲的幼蟲[2]。家蠅，又名大頭蠅、紅點蠅、紅頭蠅、羅仙子、水仙子等?！侗静菥V目》蟲目第40卷指出：“凡疔瘡、臁爛可用家蠅研末，香油調而外敷。鮮者更妙，取咸寒解毒，蠕動攻散也”。醫學上認為，作為傳統中藥材的五谷蟲外敷有治療臁瘡的作用。

溶菌酶(Lysozyme)又稱胞壁質酶(Muramidase)或N-乙酰胞壁質聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase)，是一種堿性蛋白質[3]。溶菌酶分為3種類型：c 型，主要代表是雞蛋清溶菌酶(Chicken egg-white lysozyme，cL)；g 型，主要代表是鵝蛋清溶菌酶(Goose egg-white lysozyme，gL)；噬菌體溶菌酶型[4]。溶菌酶在機體先天免疫中發揮重要作用，是一種非特異性免疫因子，可以通過其活性中心破壞細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4 糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂、內容物逸出，從而使細菌溶解[5]。溶菌酶作為一種無毒副作用的天然抗菌蛋白，還可用于水產品和肉制品等食品的防腐保鮮，特別是可作為嬰兒食品和配方奶粉良好的添加劑[6]。

家蠅及其幼蟲主要生長在腐物、糞便和垃圾等含有大量細菌的惡劣環境中，其體表帶有許多病原菌，能傳播多種疾病，但其自身卻不受這些病原菌的影響，更不會因為感染病原菌而引起家蠅的大批死亡，說明家蠅對病原微生物有更強大的免疫力[7]。筆者所在課題組的前期研究發現，家蠅幼蟲分泌物有抗大腸埃希菌的功效，而且此抗菌物質不需任何其他的誘導便可產生[8]。從該分泌物中分離并純化到具有廣譜抗菌功能的抗菌活性蛋白，并對其進行了生物學特性研究和體內免疫活性的初步研究[9]，通過肽指紋圖譜鑒定發現幼蟲體外分泌物中的抗菌活性物質之一是溶菌酶[10]。研究表明，家蠅溶菌酶主要屬于C型溶菌酶[11]，是家蠅免疫防御系統中的一員，也是一種重要的消化酶[12]。

豬糞和雞糞富含優良的蛋白質和礦物質，是家蠅幼蟲生長發育的優良培養基[13]。研究表明，對家蠅進行集約化飼養，利用其生態功能集中轉化畜禽糞便等有機廢物，能夠將有機廢物快速熟化，轉化為生物有機肥，降低糞便等培養基中的有害物質含量[14]。然而，目前關于家蠅幼蟲在不同培養基中生長分泌的溶菌酶活性差異的報道較少。筆者研究了經過豬糞和雞糞培養后家蠅幼蟲體外分泌物中溶菌酶含量的變化，以及不同儲存條件對溶菌酶活性的影響，旨在為家蠅溶菌酶的進一步開發和利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料。家蠅(Muscadomestica)由貴州醫科大學基礎醫學院實驗室飼養傳代。成蟲以奶粉和白糖為飼料。飼養溫度為(25±1)℃，相對濕度為50%～60%，光照時間為12 h。成蟲產卵時，用飼料接卵。大腸埃希菌(Escherichiacoli) ATCC10503，購自軍事醫學科學院。新鮮豬糞和雞糞均取自貴州大學飼養場。

1.1.2 儀器與試劑。Milli-Q超純水儀(法國millipore公司)、5415R冷凍干燥離心機(德國Eppendorf公司)、冷凍干燥系統(丹麥Heto-Holten公司)、μ-Quant掃描酶標分光光度儀(美國Bio-Tek公司)；溶菌酶檢測試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養料預處理。取新鮮的豬糞和雞糞，使其相對濕度約為85%。在飼養糞便中加入20%(質量比)的麥麩，發酵10 h備用。

1.2.2 家蠅2齡和3齡幼蟲的準備。試驗組取08：00—10：00所產的家蠅卵，分別置于預處理后的豬糞和雞糞培養基中飼養，培養48 h后得到2齡幼蟲，96 h后得到3齡幼蟲。常規麥麩飼養的幼蟲為正常對照組，麥麩中加入大腸桿菌菌液(3.56 g/L)飼養的為細菌誘導組。

1.2.3 家蠅幼蟲分泌物的提取。取2齡和3齡家蠅幼蟲100 g用蒸餾水清潔體表后，浸泡于適量無菌水中，25～26 ℃條件下放置4 h，不斷振蕩。吸取浸液用0.22 μm的無菌濾器過濾除菌，獲得分泌物粗提液。

1.2.4 不同培養基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶的含量檢測。分別取試驗組和對照組蠅蛆分泌物，用藤黃微球菌作為底物，測定家蠅幼蟲溶菌酶的含量。按照試劑盒說明書計算溶菌酶含量。

1.2.5 不同儲存溫度和儲存時間幼蟲分泌物中溶菌酶的活性檢測。將豬糞飼養組的幼蟲分泌物分裝置于室溫、4 ℃、-20 ℃條件下，每隔一定時間取出，檢測其溶菌酶活性。

2 結果與分析

2.1 不同培養基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶含量的比較 由表1可知，各組3齡幼蟲分泌物中溶菌酶含量均顯著高于2齡幼蟲(P<0.05)。豬糞培養基、雞糞培養基和細菌誘導培養基中培養的2齡和3齡幼蟲，其分泌物中溶菌酶含量均顯著高于正常對照組(P<0.05)。

表1 不同培養基和不同齡期幼蟲分泌物中溶菌酶含量的比較

Table 1 The comparison of lysozyme content in the secretions of different instars of larvae cultivated with various kinds of culture media μg/mL

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Different lowercases stand for significant differences(P<0.05).

2.2 不同儲存溫度和儲存時間對幼蟲分泌物中溶菌酶含量的影響 從圖1可以看出，幼蟲分泌物在室溫下溶菌酶含量可以維持7 d，8～14 d溶菌酶活性基本消失；在4 ℃條件下放置7 d溶菌酶含量無明顯變化，但8～21 d溶菌酶含量逐漸下降，22～63 d溶菌酶含量維持在最初測定值的一半左右，64～70 d溶菌酶活性逐漸消失；放置于-20 ℃下幼蟲分泌物的溶菌酶含量一直比較穩定，64～70 d溶菌酶含量無明顯變化。

圖1 不同儲存溫度和儲存時間對溶菌酶含量的影響Fig.1 Effects of different storage temperatures and storage time on the lysozyme content

3 討論與結論

溶菌酶作為一種非特異性免疫因子，廣泛分布于生物體的體液和組織液中[15]。除了天然的抗菌活性外，人溶菌酶與機體的防御體系密切相關，其具有抗炎、抗腫瘤、提高機體免疫力等功能，同時作為內源性蛋白質，不會對人體產生不良反應和副作用[16]。大量研究表明，除植物溶菌酶存在差異外，人和動物的溶菌酶在功能和作用機制上相同或相似。家蠅溶菌酶作為重要的非特異性防御功能因子，與人溶菌酶均屬于C型溶菌酶[17]，具有廣闊的開發和利用前景。

已有研究表明，魚類消化道所分泌的消化酶對溶菌酶制品活力的影響因魚的種類和消化道部位的不同而不同[18]。為了進一步了解家蠅幼蟲的齡期及生存環境對其分泌的溶菌酶活性的影響，筆者檢測了不同培養基中飼養的2齡、3齡家蠅幼蟲分泌物的溶菌酶含量，根據在一定濃度的混濁菌液中，由于溶菌酶能水解細菌細胞壁上肽聚糖，使細胞裂解，導致細菌濃度降低，透光度增強，根據透光度來推算溶菌酶的含量[19]。該試驗結果表明，各組3齡幼蟲分泌物中溶菌酶的含量均高于2齡幼蟲。據推測，可能是因為家蠅幼蟲要經歷1齡、2齡、3齡3個時期，一般情況下1齡和2齡均為家蠅幼蟲的主要生長期，其體內主要以合成自身結構蛋白為主，分泌性蛋白的合成較少[20]。3齡幼蟲屬于生長的過渡時期，其體內積累了大量的分泌蛋白，就會產生更多的分泌性溶菌酶。3齡幼蟲的體液免疫和細胞免疫功能逐漸趨于完善，能更好地抵御外界侵害，為進入蛹期做好充分的準備。溶菌酶作為家蠅幼蟲分泌的廣譜的抗菌效應分子，其分泌量在3齡會有所提高。因此，3齡家蠅幼蟲是最佳的溶菌酶獲取時期。大腸桿菌誘導組中溶菌酶含量顯著高于正常對照組，雞糞處理組和豬糞處理組中溶菌酶含量亦高于正常對照組，因為雞糞與豬糞中含有大量的細菌、真菌和放線菌等病原菌，可推測經外界病原菌等不利因素誘導后蠅蛆可分泌更多的溶菌酶，并且豬糞和雞糞等天然培養基的誘導效果較單純大腸桿菌菌液好。

溶菌酶作為一種堿性蛋白，不同的環境條件(如溫度、pH、儲存時間)均會對其活性產生影響[20]。該研究結果表明，無論是否經大腸桿菌菌液誘導，家蠅溶菌酶含量的下降幅度隨著儲存溫度的降低而均逐漸減緩，在-20 ℃儲存溫度下家蠅溶菌酶在70 d內仍可保持較高的含量。這說明低溫有利于家蠅溶菌酶的儲存。在4 ℃條件下，誘導對照組溶菌酶含量高于正常對照組，亦可推測出大腸桿菌菌液的誘導可提高家蠅溶菌酶含量。該試驗結果可進一步揭示家蠅溶菌酶活性變化的規律，為其進一步開發和利用提供試驗支持。

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Effects of Different Culture Media and Storage Conditions on the Lysozyme Content in the Secretions of Housefly Larvae

WANG Jian-yu1, GUO Guo2*，YANG Wei-jin2et al

(1. Excellent Doctors Class in Grade 2012 in Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004; 2. School of Basic Medical Sciences, Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou 550004)

[Objective] To study the effects of different culture media and storage conditions on lysozyme content in the secretions of housefly larvae. [Method] Swine manure and chicken manure were used as the culture media to feed housefly larvae. The housefly larvae in control group were fed with wheat bran and that in induced group were fed with wheat bran with addingEscherichiacoli. The secretions of 2-instar and 3-instar housefly larvae in each group were extracted to determine lysozyme content in the secretions by using reagent kits. The secretions in 3-instar larvae in control group and induced group were extracted to analyze the changes of lysozyme content at room temperature, 4 ℃ and -20 ℃ respectively. [Result] The average lysozyme content in the secretions of 3-instar larvae in swine manure group，chicken manure group，control group and induced group were 2.462，2.782，1.019 and 2.117 μg/mL respectively， significantly higher than that in 2-instar larvae(P<0.05). The lysozyme content in the secretions of 2-instar larvae and 3-instar larvae in swine manure group，chicken manure group and induced group were higher than that in control group(P<0.05).At room temperature, lysozyme activity in control group and induced group could be maintained for about 14 days. At -20 ℃, lysozyme activity could be maintained for about 70 days. At 4 ℃，the maintenance time of lysozyme activity in control group and induced group were in between room temperature and -20 ℃， and lysozyme content in these two groups had some differences at different time. [Conclusion] The lysozyme content in the in the secretions of 3-instar larvae is higher than that in 2-instar larvae. Swine manure culture medium and chicken manure culture medium can significantly increase the lysozyme content in the secretions of 2-instar larvae and 3-instar larvae. And higher lysozyme activity in housefly larvae can be maintained at -20 ℃.

Housefly; Lysozyme; Swine manure; Chicken manure

國家自然科學基金項目(81160204)；高校博士點學科專項科研基金項目(20105215120001)；國家級大學生創新訓練項目(201310660016)。

王建宇(1993- )，男，山東德州人，本科生，專業：臨床醫學。*通訊作者，副教授，博士，從事醫學昆蟲方面的研究。

2016-09-12

S 476.3

A

0517-6611(2016)31-0005-03