遺傳性包涵體肌病一例GNE突變的檢測*

田 杰，李玉生，楊志華，駱海洋，毛澄源，許予明，史長河#

1)鄭州鐵路職業技術學院護理學院 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

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遺傳性包涵體肌病一例GNE突變的檢測*

田 杰1)，李玉生2)，楊志華2)，駱海洋2)，毛澄源2)，許予明2)，史長河2)#

1)鄭州鐵路職業技術學院護理學院 鄭州 450052 2)鄭州大學第一附屬醫院神經內科 鄭州 450052

#通信作者，男，1985年5月生，博士，主治醫師，研究方向：神經遺傳變性病，E-mail：shichanghe@gmail.com

遺傳性包涵體肌病；目標捕獲測序；GNE基因突變

目的：研究一例近親結婚導致的遺傳性包涵體肌病(HIBM)家系表型和基因型特點。方法：收集一例常染色體隱性遺傳性肌病患者，應用目標捕獲測序技術對該患者家系人員進行致病基因篩查。結果：該患者以四肢近端肌進行性無力為首發癥狀，電生理檢查提示肌源性損害；基因檢測結果顯示GNE基因發生c.C577T (p.Arg193Cys)純合錯義突變；其父母均為GNE基因c.C577T (p.Arg193Cys)雜合攜帶者；該突變在家系內同疾病表型共分離，并且在200例正常對照人群中未被發現。結論：目標捕獲測序技術可用于HIBM的診斷；c.C577T為一個新的GNE基因變異。

遺傳性包涵體肌病(hereditary inclusion body myopathy, HIBM)是一類罕見的慢性進展性常染色體隱性遺傳性肌病，病理表現為細胞核和(或)細胞漿內管絲狀包涵體形成[1-5]。HIBM主要分為股四頭肌不受累的空泡肌病(vacuolar myopathy sparing the quadriceps, VMSQ)與伴鑲邊空泡的遠端肌病(distal myopathy with rimmed vacuoles,DMRV)，二者均與尿苷二磷酸-N-乙酞氨基葡萄糖2-表位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)基因突變相關[6-9]。目前，已有超過100種GNE基因突變在多個國家多個種族中被檢測到，但我國有關GNE突變的研究較少。作者收集到一例近親婚育家庭的近端肌無力患者，應用目標捕獲測序技術最終診斷為由GNE基因的新發突變位點導致的HIBM，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 該例為就診于鄭州大學第一附屬醫院、臨床表現為常染色體隱性遺傳性肌病的患者，由兩名神經內科醫師進行詳細的病史采集、神經系統查體，詳細詢問家族史，完善肌酶學、肌電圖等檢查。收集該院2012年1月至2013年6月200例無神經精神系統疾病的健康志愿者為對照。研究得到鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，并取得受試者的知情同意。

1.2 基于高通量測序技術的目標捕獲測序 采集患者外周靜脈血3 mL，采用標準流程提取基因組DNA。參考OMIM以及HGMD數據庫，選取與遺傳性肌病相關的169個基因，利用Agilent Sure Design在線設計工具設計針對目標基因外顯子及側翼序列(±10 bp)的靶向捕獲探針，定制專門的目標基因捕獲試劑盒，共設計了30 515條捕獲探針，總大小為992.533 kb。采用Agilent Sure Select目標序列富集試劑盒制備針對患者DNA樣本的目標基因捕獲文庫，操作步驟嚴格按照說明書進行。實驗過程包括超聲破碎DNA片段、文庫構建、雜交捕獲、捕獲文庫擴增和純化等。使用Agilent Bioanalyzer 2100儀器對測序文庫的DNA樣本進行檢測，試劑為DNA chips，最后按照捕獲文庫DNA樣本濃度及測序深度要求，應用NEXTSEQ 500測序儀(美國Illumina公司)測序。

1.3 測序數據的分析 測序平臺產生的原始數據(Fastq文件)經RTA software、CASAVA software v1.8.2、BWA、Genome Analysis Toolkit生物信息學軟件分析后，評估測序質量，評估參數包括總reads數[10]、與人類基因組序列相匹配的reads比例、位于目標基因靶序列以內的reads比例、平均測序深度、測序深度大于20×區域的比例及覆蓋度均一性等，并生成單核苷酸變異(single nucleotide variation，SNV)和插入/缺失變異(insertion/deletion, Indel)報告。運用ANNOVAR軟件、PolyPhen-2.2.2軟件、HGMD數據庫、dbSNP數據庫、Genome1000數據庫進行變異注釋，篩選可能的致病位點[11]。

1.4 候選變異的Sanger驗證 應用Prime3.0設計引物序列：正義鏈5’-GAGGGGAGAAGATGAG GCAG-3’，反義鏈：5’-CCACATGCGAATGATGCTCA-3’。 PCR體系總體積為50 μL，包括250 ng基因組DNA(每條引物各12.5 pmol)、10 mmol/L Tris-HCl(pH=8．3)、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、體積分數10%二甲基亞砜、4 U Taq DNA聚合酶。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min；隨后95 ℃變性60 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，循環25次；最后72 ℃擴延5 min。反應產物由ABI 3730 DNA analyzer(生工生物工程有限公司)直接測序。測序結果應用DNASTAR v7.1軟件分析。

2 結果

2.1 臨床資料及輔助檢查結果 先證者(Ⅴ-1)，女，28歲，未婚，以“雙下肢無力4 a”為主訴入院。 4 a前無明顯誘因出現雙下肢無力，表現為雙側大腿上抬困難，后癥狀逐漸加重，出現行走不穩、步態異常癥狀。神經系統查體示：右上肢肌力5級，左上肢肌力近端4級、遠端5級，雙下肢肌力近端2級、遠端4-級；四肢肌張力正常，深淺感覺未見異常；左上肢橈反射亢進，四肢病理征陰性；步態呈“鴨步”。肌酶檢測正常。肌電圖示：四肢被檢肌可見自發電位，呈肌源性改變。該家系無其他類似癥狀患者，但先證者父母為近親婚配，符合常染色體隱性遺傳模式，系譜圖見圖1。

圖1 家系系譜圖

2.2 目標捕獲測序及Sanger驗證結果 目標捕獲測序共獲得151.5 M數據，注釋對比后共發現4 270個SNV和405個Indel，數據庫過濾后得到13個基因上的9個SNV和5個Indel。結合基因注釋和突變致病性預測，初步確定GNE基因c.C577T(p.Arg193Cys)為該患者的致病突變；進一步對家系成員(Ⅳ-1，Ⅳ-2，Ⅴ-1)進行Sanger 測序(圖2)，該患者為GNE基因純和突變，且其父母均為該突變的雜合攜帶者，此突變基因型同家系表型共分離。該突變位點在dbSNP、Genome1000數據庫中未見報道，且在200例正常對照中也未發現該突變位點。

圖2 GNE突變測序 (箭頭所示為突變位點)

3 討論

HIBM具有明顯臨床異質性，患者最初多表現為小腿前群肌肉無力與萎縮、足下垂、步態異常等，隨著病情進展,可累及下肢近端，甚至出現上肢和中軸肌肉受累，面部肌肉、呼吸肌、心肌等也可受累。包涵體肌病的臨床特征變異較大，易與炎癥性疾病、脂質沉積病、腓骨肌萎縮癥、肢帶型肌營養不良等混淆，臨床診斷比較困難。肌肉活檢對該病診斷具有重要意義，但是由于肌肉活檢受到醫院條件和患者自身心理的限制,檢查相對困難。此次收集的一例以下肢遠端無力、行走不穩為主要表現的肢帶型遺傳性肌病患者，其臨床癥狀與肌營養不良等疾病表現相似，鑒別困難。

遺傳性肌病具有明顯的遺傳異質性，其致病基因數量多，外顯子數量更是龐大。傳統的測序方法(如Sanger)對每個外顯子進行直接測序，通量較低，這使得直接測序篩查的工作量及成本巨大[12-16]。目標捕獲測序技術可一次對幾十萬到幾百萬個DNA分子進行測序，與直接測序相比，具有高通量、低成本的測序優勢。該研究中，通過對該家系患者進行目標捕獲測序，確定GNE基因的c.C577T(p.Arg193Cys)為此家系的致病突變[17-19]。

在不同種族中GNE基因突變形式與位點差別很大。Argov等[17]在對129例中東猶太人HIBM的研究中發現，GNE突變全部為12號外顯子P.M712T純和突變；而日本HIBM患者GNE基因突變形式則包括錯義突變、剪切突變、無義突變、小片段插入突變、小片段缺失突變等多種,甚至發現了大片段缺失突變[20]。在中國GNE基因突變導致的HIBM報道極少，該研究發現的GNE基因c.C577T (p.Arg193Cys)突變未見文獻報道，提示該地區HIBM的GNE突變類型可能與其他人群不同，但仍然需要大樣本的研究證實這一假說[19,21-22]。

GNE基因編碼尿苷二磷酸-N-乙酞氨基葡萄糖2-表位酶/N-乙酰甘露糖胺激酶，具有表位酶和激酶兩種功能結構域, 是在唾液酸的生物合成中起關鍵作用的雙功能限速酶。唾液酸為生物信息傳遞中的重要分子，在細胞黏附、抗原決定簇識別與信號轉導等過程中發揮重要作用。GNE突變可能導致酶活性降低，使肌纖維內唾液酸代謝紊亂，肌纖維內蛋白磷酸化異常，最終導致肌纖維的退行性變。此外尚有報道認為HIBM肌病可能與線粒體功能、細胞凋亡通路有關，具體機制可能需要進一步試驗證實[23-24]。

該突變為近親婚育家系中發現的HIBM致病基因GNE的新發突變類型，這進一步完善了中國人群中GNE的突變類型。在臨床實踐中應提高對HIBM的認識，積極應用目標捕獲測序等新一代基因測序技術對HIBM作出診斷。

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(2016-04-05收稿 責任編輯王 曼)

Identification of a novel mutation in GNE gene of hereditary inclusion body myopathy

TIANJie1),LIYusheng2),YANGZhihua2),LUOHaiyang2),MAOChengyuan2),XUYuming2),SHIChanghe2)

1)SchoolofNursing,ZhengzhouRailwayVocationalandTechnicalCollege,Zhengzhou450052 2)DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

hereditary inclusion body myopathy;target capture sequencing;GNE gene mutation

Aim: To analyze the phenotypic and genotypic characteristics in a consanguineous family presented with hereditary inclusion body myopathy(HIBM). Methods: The clinical data of an autosomal recessive myopathy pedigree were collected, and target capture sequencing technology was used to identify the pathogenic gene mutation. Results: The patient in the pedigree presented proximal limb muscles weakness as the first symptom, electrophysiological examination suggested a myogenic damage, and genetic testing results show a homozygous missense mutation c.C577T(p.Arg193Cys); the parents were both heterozygous for the c.C577T(p.Arg193Cys) mutation.The GNE gene mutation was co-segregated with the phenotype in the pedigree and was not detected in 200 normal control subjects. Conclusion: A novel GNE gene mutation is identified and target captare sequencing method is helpful for the diagnosis of HIBM.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.014

*國家自然科學基金資助項目 U1404311

R596.1