褪黑素對急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中MPO及CINC-1表達(dá)的影響*

苗金紅，朱海洋，鐘 斌，崔 浩，汪 鑫，理 陽，徐玉生#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

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褪黑素對急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中MPO及CINC-1表達(dá)的影響*

苗金紅1)，朱海洋2)，鐘 斌2)，崔 浩2)，汪 鑫2)，理 陽2)，徐玉生2)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

#通信作者，男，1969 年 3 月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向:骨科疾病的基礎(chǔ)與臨床，E-mail:ysxu@zzu.edu.cn

褪黑素：脊髓損傷：中性粒細(xì)胞趨化因子；髓過氧化物酶；大鼠

目的：探討褪黑素(MT)對大鼠急性脊髓損傷后髓過氧化物酶(MPO)及中性粒細(xì)胞趨化因子(CINC)-1表達(dá)的影響。方法：108只SD大鼠分為假手術(shù)組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。手術(shù)組大鼠僅切除T11椎板，脊髓損傷組、褪黑素治療組建立T11脊髓損傷模型。脊髓損傷組、褪黑素治療組在脊髓損傷后10 min內(nèi)分別腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的生理鹽水和100 mg/kg的褪黑素制劑。于脊髓損傷后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d分別取脊髓組織，化學(xué)法測定MPO活力變化，HE染色法觀察脊髓組織結(jié)構(gòu)，RT-PCR法觀察CINC-1 mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：脊髓內(nèi)CINC-1水平和MPO活性有相似的變化規(guī)律, 且MPO在CINC-1表達(dá)達(dá)峰之后12 h達(dá)高峰；除1 h外各時間點各組相比較，B組最高、C組次之、A組最低，其中B組與A組、C組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：褪黑素可通過抑制CINC-1的表達(dá)減少中性粒細(xì)胞的浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)，起到一定的神經(jīng)保護作用。

據(jù)報道[1-3]全球每年因脊髓損傷導(dǎo)致自主運動及感覺功能損害的患者在1 150萬至5 340萬之間，且患者生活質(zhì)量與脊髓損傷程度密切相關(guān)。脊髓損傷目前尚無有效的治療手段。脊髓損傷后繼發(fā)性引起的炎癥反應(yīng)嚴(yán)重影響著脊髓修復(fù)[4-5]，其中中性粒細(xì)胞發(fā)揮著重要作用[6]。而髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)是中性粒細(xì)胞活化的標(biāo)志物，且中性粒細(xì)胞趨化因子-1(cytokine-induced neutrophil chemoattractant,CINC-1)的濃度梯度是中性粒細(xì)胞跨越血管內(nèi)皮的基礎(chǔ)。褪黑素(melatonin,MT)是于1956年被Lerner和其同事從牛松果體組織中提取出來的兩性分子。有證據(jù)[7-10]表明褪黑素具有神經(jīng)保護、減少氧化應(yīng)激、減輕水腫等作用。但其是否可通過減少CINC-1的含量從而減輕炎癥反應(yīng)目前尚未見報道。該研究旨在通過脊髓損傷后立即注射褪黑素制劑，觀察短期內(nèi)脊髓組織中CINC-1、MPO的變化，探討褪黑素在局部炎癥反應(yīng)中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年雌性SPF級SD大鼠108只，體重(230±20) g，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2010-0002。實驗動物自由飲水、隨意進(jìn)食，12 h照明，實驗過程中對動物的操作均按照動物倫理學(xué)的要求進(jìn)行。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑、Maker、RT試劑盒、PCR試劑盒均購自Transgene公司；引物購自北京博大泰克公司；MPO測試盒購自南京建成公司；MT、DEPC、EB購自美國Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國Applied Biosystems公司)；低溫離心機(美國Sigma公司)；圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific)。

1.3 脊髓損傷動物模型的建立 用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠后，術(shù)區(qū)備皮，取俯臥位固定于手術(shù)臺上。消毒、鋪巾，取背中段正中切口，以T11為中心顯露T10～T12棘突、椎板，暴露脊髓硬膜。采用改良Allen’s WD法，自距硬膜15 cm的高度用5 g的砝碼垂直落下，建立大鼠脊髓損傷模型。觀察到砝碼砸傷后硬膜表面出現(xiàn)充血水腫，雙下肢出現(xiàn)撲動且為回縮性，尾巴出現(xiàn)擺動且為痙攣性即為造模成功。術(shù)畢大量生理鹽水沖洗手術(shù)視野，適量青霉素鈉置于切口內(nèi)預(yù)防感染，再次消毒后縫合切口。

1.4 實驗分組 108 只SD健康成年雌性大鼠隨機分為假手術(shù)組、脊髓損傷組、褪黑素治療組，每組36只。脊髓損傷組在脊髓損傷后10 min按體重腹腔注射含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的生理鹽水(MT溶劑)。褪黑素治療組給予100 mg/kg[11-12]的褪黑素制劑。假手術(shù)組僅行椎板切除而不損傷脊髓。為預(yù)防感染，每組大鼠均每日給予腹腔注射青霉素40萬單位。脊髓損傷組及褪黑素治療組術(shù)后每天給予人工輔助排尿排便4次。

1.5 HE染色檢測脊髓組織形態(tài)學(xué)變化 各組大鼠于術(shù)后1 h、6 h、12 h、1 d、3 d、5 d六個時間點再次麻醉后迅速開胸，用無菌冰生理鹽水500 mL心臟灌注，完整地切取T10～T12的脊髓組織。切取T10～T12頭端脊髓組織存放在液氮中，待行MPO活性測定及總RNA提??；切取T10～T12尾端脊髓組織浸入體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定 24 h，常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，用LE ICACM 1900恒冷箱切片機對脊髓組織作橫切面連續(xù)切片，切片厚度6 μm，放于溫水中，載玻片收集組織后，恒溫烘箱烘干進(jìn)行HE染色。

1.6 脊髓組織中CINC-1 mRNA表達(dá)水平檢測 采用 RT-PCR 擴增法。取凍存脊髓標(biāo)本于研缽內(nèi)研碎后采用Trizol法提取總 RNA，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，再以 GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行 PCR 擴增。大鼠CINC-1引物序列：上游5’-ATT AGCCTACTGGTGGTGC-3’ ，下游5’-ACAGCCTGGC CTAAGTGA-3’,擴增產(chǎn)物大小為286 bp。大鼠GAPDH引物序列：上游5’-CACGGCAAGTTCAACGGCA CA-3’，下游5’-GCGGCATGTCAGATCCACAACG-3’，擴增產(chǎn)物大小為588 bp。取 5 μL 擴增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并觀察電泳條帶，記錄圖像后進(jìn)行分析，目的基因CINC-1 mRNA的表達(dá)量用CINC-1和GAPDH條帶的灰度值比值表示。

1.7 MPO活力測定 應(yīng)用化學(xué)方法，嚴(yán)格按照髓過氧化物酶測試盒說明書測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。術(shù)后不同時間點各組大鼠脊髓組織CINC-1 mRNA表達(dá)和MPO活力的比較采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 脊髓損傷建模情況 脊髓損傷組及褪黑素治療組均出現(xiàn)尿潴留、后肢癱瘓。術(shù)后各組大鼠進(jìn)食水量、活動量明顯減少。各組大鼠切口均未出現(xiàn)感染情況。

2.2 各組脊髓組織中CINC-1 mRNA的表達(dá) 各組各時間點均出現(xiàn)286 bp 左右的特異性擴增條帶，電泳結(jié)果見圖1～3。各組脊髓組織中CINC-1 mRNA表達(dá)的比較見表1。脊髓損傷后12 h 各組大鼠脊髓中CINC-1 mRNA表達(dá)水平從高到低依次為脊髓損傷組、褪黑素治療組、假手術(shù)組(圖4)。脊髓損傷組及褪黑素治療組各個時間點CINC-1 mRNA的表達(dá)均高于假手術(shù)組，但褪黑素治療組上升程度小于脊髓損傷組。

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖1 假手術(shù)組不同時間點 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖2 脊髓損傷組不同時間點 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3、4、5、6:分別為1 h、6 h、12 h、1 d、3 d和5 d。圖3 褪黑素治療組不同 時間點脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果

M：Marker；1、2、3:分別為假手術(shù)組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。圖4 脊髓損傷后12 h各組大鼠 脊髓組織CINC-1 mRNA的RT-PCR結(jié)果表1 術(shù)后不同時間點各組大鼠脊髓組織CINC-1 mRNA的表達(dá)(n=6)

組別1h6h12h24h3d5d假手術(shù)組0.094±0.0040.091±0.0050.100±0.0130.092±0.0110.094±0.0090.094±0.008脊髓損傷組0.110±0.0040.177±0.006*0.850±0.041*0.572±0.025*0.319±0.019*0.154±0.010*褪黑素治療組0.098±0.0050.148±0.008*#0.545±0.039*#0.404±0.036*#0.208±0.016*#0.127±0.012*#

F組間=16.351，P<0.001；F時間=21.321，P<0.001；F交互=83.217，P<0.001；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與脊髓損傷組比較，P<0.05。

2.3 各組大鼠脊髓組織MPO活力比較 結(jié)果見表2。

表2 術(shù)后不同時間點各組大鼠脊髓組織MPO 活力比較(n=6)

F組間=173.615，P<0.001；F時間=21.321，P<0.001；F交互=18.151，P<0.001；*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與脊髓損傷組比較，P<0.05。

2.4 各組脊髓組織HE染色結(jié)果 見圖5。脊髓損傷組和褪黑素治療組脊髓組織中可見中性粒細(xì)胞浸潤、組織內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂等變化，褪黑素治療組上述變化較脊髓損傷組輕。假手術(shù)組脊髓結(jié)構(gòu)無中性粒細(xì)胞浸潤、出血等變化。

A、B、C:分別為假手術(shù)組、脊髓損傷組、褪黑素治療組。圖5 各組大鼠脊髓組織HE染色結(jié)果(×400)

3 討論

褪黑素作為人體內(nèi)重要的神經(jīng)內(nèi)分泌活性物質(zhì)，對生物的衰老、氧化應(yīng)激、晝夜節(jié)律、腫瘤、性成熟及生殖、免疫反應(yīng)等均有調(diào)節(jié)作用。作者前期的實驗證實在急性脊髓損傷后給予100 mg/kg的褪黑素可明顯抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、提高神經(jīng)生長因子表達(dá)等作用[13-14]。

CINC-1與人類IL-8功能及結(jié)構(gòu)相近，是人類IL-8的對應(yīng)物。它不僅能特異性介導(dǎo)中性粒細(xì)胞跨越血管內(nèi)皮，還能誘導(dǎo)細(xì)胞膜表面表達(dá)黏附分子DC11b/CD18，使中性粒細(xì)胞結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞的能力增加[15]。而中性粒細(xì)胞的聚集、浸潤是炎性反應(yīng)發(fā)生的關(guān)鍵步驟。中性粒細(xì)胞能夠活化和釋放氧化物增加內(nèi)皮黏附分子的表達(dá)，其中的彈性蛋白酶能增加血管通透性并能損害內(nèi)皮細(xì)胞完整性進(jìn)而影響脊髓損傷的發(fā)展進(jìn)程[16-17]。該實驗檢測了各組各個時間點CINC-1的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)CINC-1在脊髓未受損傷的假手術(shù)組中均有少量表達(dá)且表達(dá)量在各個時間點無明顯變化。脊髓損傷組CINC-1表達(dá)在各個時間點均有明顯的增高，且在12 h達(dá)高峰，提示可能CINC-1參與了繼發(fā)性脊髓損傷的過程。而褪黑素治療組在脊髓損傷后6 h、12 h、1 d、3 d CINC-1 mRNA的表達(dá)均低于相同時間點的脊髓損傷組，提示在脊髓損傷后應(yīng)用褪黑素可抑制CINC-1的表達(dá)。

中性粒細(xì)胞中存在大量的 MPO。它與中性粒細(xì)胞的絕對數(shù)量相關(guān)聯(lián)，是一個定量中性粒細(xì)胞對損傷組織浸潤的特異和敏感標(biāo)記。該研究用化學(xué)方法檢測了MPO在假手術(shù)組、脊髓損傷組及褪黑素治療組中的變化情況，發(fā)現(xiàn)在假手術(shù)組中能檢測出低活力的MPO，但隨著時間變化MPO活力無明顯變化。在脊髓損傷組，損傷區(qū)脊髓組織內(nèi)MPO活力明顯升高，傷后1 d達(dá)高峰。隨著觀察時間的延長，MPO活力逐漸減弱，但至脊髓損傷后5 d仍維持較高水平。褪黑素治療組與脊髓損傷組有相同的變化規(guī)律，且褪黑素治療組在脊髓損傷后 6 h、12 h、1 d、3 d MPO活力明顯低于脊髓損傷組。該研究結(jié)果表明MPO與CINC-1有相似的表達(dá)規(guī)律，MPO活力在CINC-1表達(dá)達(dá)高峰之后12 h也達(dá)峰值。

綜上所述，作者認(rèn)為CINC可能通過介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤而參與繼發(fā)性脊髓損傷過程，而且在急性脊髓損傷后給予褪黑素，會通過抑制CINC-1的表達(dá)減少中性粒細(xì)胞對損傷脊髓的浸潤，從而減輕炎癥反應(yīng)，起到一定的神經(jīng)保護作用。

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(2016-01-22收稿 責(zé)任編輯李沛寰)

Effects of melatonin on expression of MPO and CINC-1 in rats with acute spinal cord injury

MIAOJinhong1),ZHUHaiyang2),ZHONGBin2),CUIHao2),WANGXin2)，LIYang2),XUYusheng2)

1)TheFirstAffiliatedHospital,Zhengzhou450052 2)DepartmentofOrthopedics，theFirstAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450052

melatonin;spinal cord injury;cytokine-induced neutrophil chemoattractant;myeloperoxidase；rat

Aim: To investigate the effects of melatonin(MT) on expression of myeloperoxidase(MPO) and cytokine-induced neutrophil chemoattractant(CINC)-1 in rats after acute spinal cord injury. Methods: Totally 108 SD rats were randomly allocated into 3 groups:sham operation group(group A，n=36),spinal cord injury group (group B，n=36), and MT treatment group (group C，n=36). Group B and C were established SCI animal models at T11 level. Lamina of vertebra was cut without spinal cord injury in the sham operation group. The rats of group C were injected 5%(V/V) alcohol into abdominal cavity after spinal cord injury while the rats of group B were injected MT(100 mg/kg). Fetching the spinal tissue at 1 h, 6 h, 12 h, 1 d, 3 d and 5 d after spinal cord injury. Chemical method was used to detect the expression of MPO. HE staining was performed to observe the pathological changes of the spinal cord in the 3 groups respectively. RT-PCR was used to detect the expression of CINC-1 mRNA in spinal cord tissue. Results: There were similar changing patterns of contents of CINC-1 and MPO, and the peak time of MPO was 12 h later than CINC-1. Compared the three groups except 1 h,group B had the highest level and group A had the lowest level regarding to the contents of CINC-1 and MPO, and the differences among them were statistical(P<0.05).Conclusion: MT could inhibit the expression of CINC-1 and reduce neutrophil infiltration,thus relieve inflammation reaction and protect spinal cord from damage.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.017

*河南省國際科技合作項目 134300510005

R681.5+4