慢性不可預見性心理應激致大鼠顳下頜關節損傷髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白的表達*

董 晶，黎 婷，宋文婷，蔡文燕，王 超，孫晉虎

1)徐州醫科大學口腔醫學院 徐州 221004 2)徐州醫科大學附屬醫院口腔科 徐州 221004

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慢性不可預見性心理應激致大鼠顳下頜關節損傷髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白的表達*

董 晶1，2)，黎 婷1)，宋文婷1)，蔡文燕1)，王 超1)，孫晉虎1,2)#

1)徐州醫科大學口腔醫學院 徐州 221004 2)徐州醫科大學附屬醫院口腔科 徐州 221004

#通信作者，男，1969年9月生，博士，主任醫師，教授，研究方向：口腔頜面疾病，E-mail：jinhu-sun@sohu.com

慢性不可預見性心理應激；顳下頜關節；凋亡；TNF-α；Caspase-3；大鼠

目的：通過慢性不可預見性心理應激建立大鼠顳下頜關節損傷模型，探討髁突的病理性改變和可能的作用機制。方法：選取7周齡雄性SD大鼠64只，分為空白對照(CON)組及心理應激(PS)組。PS組予以慢性不可預見性心理應激，建立大鼠顳下頜關節損傷模型。各組于實驗1、3、5、7周各處死8只大鼠，測定大鼠體重，并通過HE染色了解髁突的組織形態學改變，采用免疫組化PV染色法了解髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白的表達情況。結果：與CON組相比，PS組大鼠體重增長較慢，5、7周時體重下降明顯(P<0.05)。此外，PS組大鼠髁突出現了膠原松解、水腫等病理性改變，其中3周時損傷最為嚴重，表現為細胞膠原纖維松解、斷裂，形成大小不一的裂隙；5周時髁突表層纖維松解的情況較3周有所減輕，但細胞層次略紊亂；7周時髁突內部細胞數目減少，出現了無細胞空白區域。PS組大鼠髁突組織中TNF-α、Caspase-3蛋白的表達均較CON組升高(P<0.05)。結論：慢性心理應激可致大鼠體重及顳下頜關節髁突組織結構改變，可能是通過上調炎癥因子及凋亡相關蛋白的表達，促進髁突軟骨細胞凋亡來實現的。

顳下頜關節紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)是口腔頜面系統常見的疾病，累及顳下頜關節和(或)咀嚼肌系統，具有疼痛、關節彈響、張口受限、下頜運動異常等相關癥狀，是多種致病因素共同作用的結果[1]。隨著研究的深入，越來越多的研究者[2-3]認為TMD是一種心身疾病，心理應激因素在其發生、發展和預后的過程中起著重要的作用。然而心理應激致TMD的機制尚未完全明確，作者擬通過建立慢性不可預見性心理應激(chronic unpredicted mild stress，CUMS)大鼠顳下頜關節損傷模型，觀察髁突組織形態學變化，并了解其可能的作用機制，為治療心理應激所致的顳下頜關節損傷提供思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 HE染色試劑盒購自碧云天公司，TNF-α相關抗體購自Abcam公司，Caspase-3相關抗體購自蘇州睿瀛生物技術有限公司，免疫組織化學PV染色法試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.2 實驗動物和分組 選取7周齡體重(200±20) g的雄性SD大鼠(由徐州醫科大學實驗動物中心提供)。實驗前采用曠場實驗對大鼠情緒狀態進行評估，選取在正常情緒狀態的64只大鼠作為研究對象，將動物隨機分為心理應激組(psychological stress，PS組)和空白對照組(CON組)，各組再分為1、3、5、7周處理時間點(n=8)。

1.3 CUMS模型的建立 根據Luo等[4]的應激模型建立方法并加以適當改進，由禁水24 h、禁食24 h、應用潮濕墊料24 h、4 ℃強迫游泳 5 min、45 ℃強迫游泳5 min、晝夜顛倒12 h/12 h、傾斜鼠籠24 h等因素構成。PS組大鼠在每日上午8：00～9:00隨機予以上述刺激，每種刺激每周有且只出現1次。PS組和CON組的飼養條件相同。實驗前，各組大鼠體重和行為學均衡，具有可比性。

1.4 體重測定 若模型動物的體重較對照組降低可視為建模有效[5]。分別在1、3、5、7周最后1次應激結束后，測量CON組和PS組大鼠的體重。

1.5 大鼠髁突的改變

1.5.1 HE染色 處死大鼠后，取雙側髁突，左側髁突用40 g/L多聚甲醛固定24 h，100 g/L EDTA脫鈣4周，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，常規石蠟包埋，制成5 μm石蠟切片。一部分用于HE染色，經常規脫蠟復水后，HE染色，脫水、透明、封片。

1.5.2 髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白的表達 另一部分經復水后，高火3 min、低火15 min檸檬酸鹽抗原修復，體積分數3% H2O2滅活10 min，體積分數10%山羊血清封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜，復溫后免疫組化PV法試劑1、2分別在37 ℃孵育30 min，DAB染色2 min，復染，分化、脫水、透明、封片。免疫組化評分方法參照文獻[6]，進行半定量評分。蛋白的表達以細胞質或核內出現(棕)黃色顆粒為陽性。將所采集標本 100 倍染色圖像導入 Photoshop CS4 軟件，在髁突軟骨中隨機選擇 5個正方形區域，可覆蓋全部軟骨增殖層、肥大層及部分鈣化軟骨層，計數區域內的陽性細胞百分率。由兩個對實驗設計不了解的病理專業人員進行圖片采集和計數。

1.6 統計學處理 應用SPSS 16.0進行分析，各組大鼠不同時間點體重、髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白表達的比較采用重復測量數據的方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠體重變化情況 見表1。CON組大鼠體重增長比較快，而PS組的大鼠增長速度緩慢，甚至部分大鼠體重出現了負增長，5周后，PS組的體重較CON組下降。

表1 各組大鼠體重變化情況(n=8) g

F組間=5.795，P<0.001;F時間=4.237，P<0.001;F交互=4.750，P<0.001。

2.2 HE染色結果 見圖1。CON組中的髁突表面光滑，髁突由外到內可分為纖維層、增殖層、肥大層和鈣化軟骨層，每一層間細胞層次清楚、排列規則而有序，纖維層明顯，膠原纖維致密而厚實。PS組，1周時髁突表面出現了膠原纖維松解情況，纖維層中出現了小的裂隙；3周時，這種裂隙進一步增大，纖維層也開始變薄；5周時髁突表面損傷、破裂的情況較3周時略顯減輕；7周時，髁突內軟骨細胞減少，甚至出現了無細胞的空白區域。

1：CON組；2：PS組；A、B、C、D：分別為1、3、5、7周。圖1 各組大鼠髁突組織的HE染色結果(HE，×100)

2.3 各組大鼠髁突組織中TNF-α和Caspase-3蛋白的表達 結果見表2、3和圖2、3。CON組髁突組織中，TNF-α和Caspase-3蛋白的表達量都很低，散在表達于軟骨淺層的胞質中。而PS組中，TNF-α陽性細胞彌散性地分布在髁突淺層至深部，TNF-α的陽性細胞百分率明顯升高，尤以1周組的陽性表達最為明顯，提示：心理應激使髁突產生了炎性改變，并且這種改變在應激初期最為明顯。而PS組髁突組織中Caspase-3也較CON組明顯增多，部分區域呈局灶性聚集，與TNF-α的變化基本趨勢一致。

表2 各組大鼠髁突組織 中TNF-α蛋白的表達(n=8) %

F組間=26.831，P<0.001;F時間=8.671，P<0.001;F交互=8.081，P<0.001。

表3 各組大鼠髁突中 caspase-3蛋白的表達(n=8) %

F組間=11.873，P<0.001;F時間=8.565，P<0.001;F交互=7.931，P<0.001。

1：CON組；2：PS組；A、B、C、D：分別為1、3、5、7周。圖2 各組大鼠髁突組織中TNF-α蛋白的表達(PV，×100)

1：CON組；2：PS組；A、B、C、D：分別為1、3、5、7周。圖3 各組大鼠髁突組織中Caspase-3蛋白的表達(PV，×100)

3 討論

心理應激在機體受到各種內外環境刺激時所產生，過度的應激可能對身體造成不良影響[7-9]。有報道[10]稱，人類疾病的75%～90%與應激機制的激活有關。TMD被認為與心理應激密切相關，并且有研究[11]表明可通過單獨的心理治療而有效改善顳下頜關節疾病的預后。該實驗成功建立了大鼠CUMS模型，發現應激后大鼠體重增長逐漸減慢，呈現出一種飲食減少的抑郁狀態。可能是由于應激強度過大或應激時間過長后致海馬受損，導致大鼠出現興趣缺失，從而引起一系列抑郁癥狀的產生[12]。

軟骨細胞是正常關節軟骨內部惟一的細胞成分，對正常軟骨形態和功能的維持與修復具有重要的作用[13]。當外界刺激因素造成軟骨細胞數目減少時，軟骨細胞外基質的分泌量便會減少，髁突會出現病理性改變。該研究結果表明應激1周時，PS組大鼠關節表面出現膠原纖維的斷裂，髁突表面變得不平整；隨著應激時間的延長，這種病理性改變進一步增強，3周時出現了較大范圍的髁突表層損傷；5周時又出現了損傷程度減小的情況，提示髁突具有抵抗外界刺激、自我修復的能力；而在應激7周時，髁突表層的纖維層厚度降低，細胞數目減少，在增殖層和肥大層出現了無細胞的空白區域。這與以往研究[14]所證實的該區域更易受到異常生物力影響吻合，也提示髁突的自我修復能力有限。

Caspase即半胱天冬氨酸蛋白酶，是目前已證實在細胞凋亡過程中起主要作用的生物大分子[15]。目前已知的細胞凋亡通路主要為內源性細胞凋亡通路和外源性細胞凋亡通路[16]。內源性細胞凋亡通路是以線粒體為中心的細胞凋亡通路，與Caspase-9及其下游效應Caspases的激活相關[17]。外源性細胞凋亡信號通路，又稱為死亡受體通路，與Caspase-8和Caspase-3的活化密切相關[18]。Caspase-3是參與細胞凋亡的重要執行者[19-20]。Wang等[21]發現外源性雌激素可通過激活Fas,FasL,Caspase-3和Caspase-8，加重大鼠顳下頜關節骨關節炎的發生發展。Caspase-3可由炎癥因子等激活，TNF-α作為一種重要的炎癥因子，也是細胞凋亡過程中的重要媒介，跟顳下頜關節損傷的關節密切。Lee等[22]通過對臨床上表現為疼痛、張口受限和關節彈響的顳下頜關節病患者的關節滑液檢查，發現其IL-6、TNF-α的表達明顯高于正常人。Spears等[23]通過關節腔注射富含TNF-α的佐劑，發現TMJ中出現了Caspase-8和Caspase-3的高表達，并且關節內細胞凋亡明顯增加，提示外源性TNF-α可能通過激活細胞凋亡通路對關節造成損傷。作者的研究發現應激后大鼠髁突中TNF-α的表達水平升高，尤以應激1周時表達水平最高，可能因應激初始時關節的炎癥反應最為明顯迅速，隨著應激時間延長，TNF-α的表達降低。Caspse-3的表達趨勢與TNF-α相似，表現為初期水平較高，后出現了一定程度的降低。以上結果提示應激可通過上調炎癥因子表達、激活凋亡相關蛋白，促進軟骨細胞凋亡而造成關節的損傷。而細胞數目的減少使關節的自我修復、支持和營養作用降低。

總之，慢性不可預見性心理應激對大鼠髁突軟骨改建活動產生了影響，這種影響可能與激活TNF-α信號通路，上調凋亡相關蛋白Caspase-3的表達，造成軟骨細胞數目減少相關，今后可對這種影響的特點、規律進行深入研究，進一步揭示其在顳下頜關節損傷中的作用，以期為治療應激所致的關節損傷提供幫助。

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(2016-01-20收稿 責任編輯李沛寰)

Expressions of TNF-α and Caspase-3 in damaged temporomandibular joint tissue induced by chronic unpredicted mild stress in rats

DONGJing1,2),LITing1),SONGWenting1),CAIWenyan1),WANGChao1),SUNJinhu1，2)

1)SchoolofStomatology,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004 2)DepartmentofStomatology,theAffiliatedHospital,XuzhouMedicalUniversity,Xuzhou221004

chronic unpredicted mild stress；temporomandibular joint；apoptosis；TNF-α；Caspase-3;rat

Aim: To observe the structure changes and possible mechanism of the temporomandibular joint(TMJ)condylar cartilage damage induced by chronic unpredicted mild stress(CUMS) in rats. Methods: Totally 64 male SD rats aged 7-weeks were randomly allocated into 8 groups, which were blank control group(1，3，5，7 weeks) and psychological stress(PS) group(1，3，5，7 weeks),and the rats were treated by CUMS except those in blank control group. After corresponding weeks CUMS treatment, the body weight was measured and the HE staining was used to research the condylar morphology change, the immunohistochemical staining was applied to detect the expressions of TNF-α and Caspase-3 proteins in condylar.Results: The rats inPS group grew slowly in weight, which showed significant differences from the fifth week(P<0.01). Besides, edema and releases of collagen fiber in the condylar surface were observed. The most serious damage of condylar surface was formed in the 3rd week in the PS group, characterized by loosen collagen fiber, and fracture of cracks. In the 5th week, the damage of condylar surface in PS group was alleviated, but the layers of cells was slightly disordered. In the 7th week, the cells in condylar decreased significantly, appearing the blank area without cells. At the same time, the immunohistochemical staining showed the higher expression of TNF-α and Caspase-3 in the PS group than those in the blank control group(P<0.05).Conclusion: CUMS can lead to changes in body weight and structure of TMJ, by up-regulating the expression of TNF-α and Caspase-3 in condylar cartilage of TMJ and induce cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.015

*江蘇省高校“青藍工程”中青年學術帶頭人項目 2014年；徐州市推動科技創新后補助備案項目 KC14SH114；徐州醫學院優秀人才科研基金項目資助 2014年

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