脂肪間充質干細胞治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的效果*

薛 鵬,李金鳳,劉新珊,劉 金,劉鳳姣,秦亞茹,段海峰#,王運良#

1)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014 2)中國人民解放軍第148醫院神經內科 淄博 255330 3)軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所 北京 100853

?

脂肪間充質干細胞治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的效果*

薛 鵬1),李金鳳2),劉新珊2),劉 金3),劉鳳姣3),秦亞茹3),段海峰3)#,王運良1)#

1)鄭州大學第二附屬醫院神經內科 鄭州 450014 2)中國人民解放軍第148醫院神經內科 淄博 255330 3)軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所 北京 100853

#通信作者：王運良，男，1964年10月生，博士，教授，研究方向：神經病學，E-mail：wangyunliang81@163.com；段海峰，男，1973年6月生，博士，教授，研究方向：白血病的干細胞治療，E-mail：duanhf0720@163.com

多發性硬化；脂肪間充質干細胞；自身免疫性腦脊髓炎；調節性T細胞；小鼠

目的：觀察脂肪間充質干細胞(ADMSC)移植治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠的療效。方法：實驗第0、7天采用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白作為抗原與完全弗氏佐劑免疫小鼠，ADMSC組(n=14)小鼠于免疫后第14、21、28天尾靜脈注射ADMSC(5.5×106個/只)，EAE組(n=13)注射同等體積的生理鹽水；對照組(n=12)不免疫，不給予ADMSC。實驗過程中對小鼠進行神經功能缺損評分；第33天，取脊髓行病理觀察，進行炎性細胞浸潤評分和脫髓鞘評分；ELISA法檢測小鼠外周血TNF-α、IL-17和IL-4水平；流式細胞術測定小鼠脾臟中CD4+Foxp3+T細胞(Treg)的比例。結果：與EAE組相比，ADMSC組小鼠神經功能缺損評分、脊髓組織中炎性細胞浸潤和脫髓鞘評分降低(P<0.05)；外周血IL-4水平升高，而TNF-α和IL-17水平降低(P<0.05)；脾臟中Treg細胞比例明顯升高(P<0.05)，接近對照組水平。結論：ADMSC移植可顯著改善EAE小鼠的神經功能。

多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主要特點的自身免疫性疾病。該病病程呈現緩解-復發的發作過程，多次發作可導致運動功能障礙，最終可致全身癱瘓，嚴重影響患者的日常生活，降低患者的生活質量[1]。現階段對MS治療有效的藥物是芬戈莫德，該藥是一種新型免疫抑制劑，具有強大的免疫抑制功效，但有一定的局限性及不足，最常見的不良反應有頭痛、流感癥狀、腹瀉、背痛、肝轉氨酶升高和咳嗽等。間充質干細胞具有強大的免疫調節和分化修復功能，間充質干細胞移植治療逐漸成為MS的研究熱點[2-6]。脂肪間充質干細胞(adipose mesenchymal stem cell，ADMSC) 因具備多向分化能力及抗炎作用等優點已成為移植修復多種疾病損傷的種子細胞之一[7-8]。作者建立了實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)小鼠模型，觀察ADMSC移植后小鼠臨床癥狀、神經功能、炎性因子表達和調節性T細胞(regulatory T cell,Treg)比例的變化，為ADMSC治療MS的可行性提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物、細胞和試劑 SPF級健康雌性C57BL/6小鼠42只，體重16～20 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。ADMSC由軍事醫學科學院二所三室細胞庫保存。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55(MOG35-55)，純度>95%，購自上海吉爾生化有限公司;百日咳毒素(PTX)和弗氏完全佐劑(CFA)購自美國Sigma公司；TNF-α、IL-4和IL-17 ELISA檢測試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；CD4-FITC、Foxp3-PE抗體購自美國Biolegend公司。

1.2 EAE模型的構建 參照Hesske等[9]報道的方法建立EAE小鼠模型。簡述如下：用0.01 mol/L的PBS稀釋MOG35-55至終濃度為1 g/L，然后將MOG35-55稀釋液與等體積CFA(結核分枝桿菌終濃度為5 g/L)混合，用10 mL注射器反復抽打混合液至油包水狀態，制做成誘導EAE所需要的抗原乳劑。記免疫當天為第0天。分別于第0天和第7天在小鼠側腹部兩點皮下注射抗原乳劑0.1 mL，于第0、2天腹腔注射百日咳疫苗0.2 mL/只(含300 ng PTX)。

1.3 實驗分組 根據體重隨機選取12只作為對照組，余30只制備EAE模型。造模過程中3只小鼠死亡，余27只隨機分為EAE組(13只)和ADMSC組(14只)。ADMSC組小鼠分別在第14、21、28天尾靜脈注射ADMSC(5.5×106個/只，0.2 mL)，EAE組注射同等體積的生理鹽水。對照組小鼠給予生理鹽水代替抗原乳劑，不接種百日咳疫苗，不注射ADMSC。

1.4 觀察指標

1.4.1 小鼠一般狀況 第0天開始至第33天，每日稱量小鼠體重，密切觀察小鼠攝食情況，并采用雙盲法進行神經功能缺損評分。評分標準采用0～5級評分法：無任何癥狀為0分；尾巴張力降低或輕度步態笨拙為1分；雙側后肢力量輕度減弱為2分；雙側后肢力量明顯減弱為3分；雙側后肢完全癱瘓為4分；后肢癱瘓合并前肢力量減弱或瀕死狀態為5分。

1.4.2 病理學觀察 第33天通過腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉小鼠，無菌剖開胸腔并露出心臟，通過左心室灌注無菌生理鹽水至肝臟變白，之后再用多聚甲醛灌注固定，將小鼠脊髓取出后立即浸入多聚甲醛中固定，石蠟包埋，5 μm厚切片。①HE染色，光鏡下觀察小鼠脊髓炎性細胞浸潤情況。評分標準：0分，無炎性細胞；1分，少數炎性細胞散在分布；2分，較多炎性細胞浸潤在脊髓血管周圍；3分，脊髓中形成較多的血管套并延伸到鄰近區域內，或鄰近區域內的浸潤未形成血管套。②為了檢測脊髓髓鞘脫失情況，進行固綠髓鞘染色(LFB)。脫髓鞘評分標準：0分，無髓鞘脫失；1分，1個小的脫髓鞘病灶；2分，2～3個脫髓鞘小病灶；3分，1～2個大的脫髓鞘病灶；4分，廣泛髓鞘脫失且脫髓鞘面積大于白質總面積的20%。

1.4.3 小鼠外周血中TNF-α、IL-4和IL-17水平測定 摘取小鼠眼球取外周血，使血液自然流出(防止溶血)，滴于1.5 mL EP管中，室溫靜置30 min，4 ℃12 000 r/min離心15 min，吸取上層血清，-20 ℃保存備用。按照ELISA檢測試劑盒說明書的要求檢測外周血中TNF-α、IL-4及IL-17水平。

1.4.4 小鼠脾臟Treg細胞比例的測定 第33天，頸椎脫臼法處死小鼠，每組3只，碾碎小鼠脾臟，在小鼠淋巴細胞分離液輔助下，離心獲取脾臟細胞懸液，每只小鼠取細胞為1.5×106個，用CD4-FITC、Foxp3-PE抗體標記細胞，上流式細胞儀，用FlowJo 軟件分析CD4+Foxp3+T細胞的比例。

1.5 統計學處理 實驗數據采用SPSS 10.0分析，EAE與ADMSC組小鼠神經功能缺損評分、炎性細胞浸潤評分和脫髓鞘評分的比較采用兩獨立樣本t檢驗，3組小鼠體重、外周血細胞因子水平和脾臟中Treg細胞比例的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組小鼠疾病表現 EAE組小鼠從免疫后第9至第11天陸續發病，表現為毛色發暗，尾部遠端下垂拖地，反應較遲鈍，活動減少，食欲較差、攝食量減少，體重逐漸下降，神經功能缺損評分逐漸增加。第15～18天小鼠發病達到高峰期，表現為步態蹣跚不穩、跌倒，尾部完全無力、拖地，雙側后肢完全癱瘓，不能行走，嚴重時前肢也無力，甚至達到瀕死狀態。疾病高峰期過后，大部分小鼠的癥狀有所緩解，神經功能缺損評分降低，個別小鼠出現緩解后再加重的癥狀。ADMSC組小鼠治療前表現同EAE組，治療后癥狀逐漸緩解，第30天后大部分小鼠僅遺留有尾部拖垂的癥狀，呈EAE慢性病程表現。

從第18天開始，ADMSC組小鼠神經功能缺損評分明顯低于EAE組小鼠(圖1)。對照組小鼠體重逐天增加；EAE組和ADMSC組小鼠體重從第13天開始逐漸下降，在發病高峰期降至最低，之后逐漸增加，2組小鼠體重變化上差異并無統計學意義(圖1)。

圖1 3組小鼠神經功能缺損評分和體重的變化

2.2 小鼠脊髓病理學改變 第33天，對照組小鼠脊髓未發現明顯的病理異常變化，脊髓炎性細胞浸潤評分和脫髓鞘評分均為0。EAE組脊髓有大量炎性細胞浸潤，小血管附近呈“袖套樣”浸潤，存在髓鞘脫失；ADMSC組炎性細胞明顯減少，髓鞘脫失情況好轉(圖2、表1)。

圖2 對照組(A)、EAE組(B)、ADMSC組(C)小鼠脊髓HE(1)、LFB(2)染色(×100)表1 EAE組和ADMSC組小鼠 脊髓炎性細胞浸潤評分、脫髓鞘評分的比較

組別n炎性細胞浸潤評分脫髓鞘評分EAE組132.99±0.192.97±0.20ADMSC組141.56±0.141.74±0.15t22.19318.077P<0.001<0.001

2.3 3組小鼠外周血TNF-α、IL-4及IL-17水平的比較 第33天，與對照組比較，EAE組小鼠外周血TNF-α 和IL-17水平升高，IL-4水平降低；與EAE組比較，ADMSC組小鼠外周血TNF-α 和IL-17水平降低，IL-4水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 3組小鼠外周血 TNF-α、IL-4及IL-17水平的比較 μg/L

*：與對照組比較，P<0.05；#：與EAE組比較，P<0.05。

2.4 3組小鼠脾臟Treg細胞比例的比較 對照組、EAE組和ADMSC組小鼠脾臟Treg細胞比例分別為(11.41±1.20)%、(5.28±2.20)%和(10.87±0.80)%，3組比較，差異有統計學意義(F=65.090,P<0.001)；EAE組較對照組顯著降低(P<0.05)；而ADMSC組較EAE組明顯升高(P<0.05)，并與對照組相比無明顯差異(P>0.05)。

3 討論

MS是一種自身免疫性中樞神經系統慢性炎性脫髓鞘性疾病，神經系統炎癥反應、神經元軸突損害和髓鞘脫失是其3個重要病理改變；炎癥反應造成神經元髓鞘脫失，炎癥反應和髓鞘破壞又損傷軸突，最終導致神經退行性病變和損傷[10-11]。目前，對于MS主要采取免疫調節治療，但由于缺乏有效的髓鞘再生機制以及神經元不可逆的損傷和軸突損害，治療效果并不理想。近幾年來，很多研究者[2-5]發現通過干細胞移植治療可以改善局部損傷微環境，從而促進髓鞘及神經的修復和再生，減少軸突損傷，促進形成新的突觸聯系并使神經信息傳導功能得以恢復。

ADMSC移植是一種潛在的促使髓鞘再生和修復的有效手段[12-16]。ADMSC不僅具有免疫調節功能，還可以調節炎性因子的表達，而且具有神經修復功能和多向分化能力，可減輕神經系統的炎癥反應，進而減少神經系統白質的髓鞘脫失。ADMSC可分化為神經元和神經膠質細胞，新生的神經元細胞可以彌補受損細胞的功能，使神經功能得以維持。

該實驗中，作者通過注射抗原佐劑建立EAE小鼠模型，并在小鼠發病高峰期尾靜脈注射ADMSC(5.5×106個/只)，觀察小鼠的發病情況、體重變化、神經功能缺損評分和病理學改變。研究結果表明，尾靜脈注射ADMSC后EAE小鼠的神經功能缺損評分顯著下降，臨床癥狀明顯減輕，炎性細胞浸潤和髓鞘脫失現象明顯減少。在EAE病理過程中，Th1型和Th2型細胞關系失衡，Th1型細胞、單核細胞及巨噬細胞參與了EAE的脫髓鞘過程，由Th1型細胞產生的TNF-α、IL-17等促炎細胞因子可促進T細胞和巨噬細胞的活化，并且可以直接破壞血腦屏障，使炎性細胞進入神經系統，造成神經系統髓鞘脫失，在MS的發病機制中起關鍵作用。Th2型細胞產生的如IL-4、IL-10等抗炎細胞因子在延緩MS病理過程中有著不可替代的作用，可促進EAE的恢復[3,17-18]。該實驗中，尾靜脈注射ADMSC后，EAE小鼠外周血TNF-α、IL-17水平顯著降低，IL-4水平增加，提示ADMSC移植可促使細胞向Th2型細胞方向分化，改變體內促炎和抗炎細胞因子的平衡，使中樞神經系統內形成一種抑炎的微環境，從而發揮神經保護作用和髓鞘保護作用。

實驗中還發現，EAE組小鼠脾臟Treg細胞比例明顯高于對照組；尾靜脈注射3次ADMSC后，ADMSC組小鼠脾臟Treg細胞比例明顯升高，遠高于EAE組；表明ADMSC可以促使原始細胞向Treg細胞分化，從而發揮免疫調節和免疫抑制作用，延緩疾病進展。

綜上所述，ADMSC移植可以明顯改善EAE小鼠神經功能缺損癥狀，縮短、延緩病程，減少神經系統白質髓鞘缺失，減輕神經系統炎癥反應，有望成為治療MS的一種新的方法。該研究為ADMSC在臨床上治療MS甚至其他脫髓鞘疾病提供了一定的實驗依據。

[1]王菊蓉,張冉,王棟,等.C57BL/6小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立[J].第二軍醫大學學報,2006,27(10):1089

[2]MERKLER D,ERNSTING T,KERSCHENSTEINER M,et al.A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination[J].Brain,2006,129(Pt 8):1972

[3]CONSTANTIN G,MARCONI S,ROSSI B,et al.Adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate chronic experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Stem Cells,2009,27(10):2624

[4]ZHANG J,LI Y,CHEN J,et al.Human bone marrow stromal cell treatment improves neurological functional recovery in EAE mice[J].Exp Neurol,2005,195(1):16

[5]PAYNE NL,SUN G,MCDONALD C,et al.Distinct immunomodulatory and migratory mechanisms underpin the therapeutic potential of human mesenchymal stem cells in autoimmune demyelination[J].Cell Transplant,2013,22(8):1409

[6]陳虎，丁國梁.間充質干細胞在多發性硬化癥治療中的應用：全球研究探索與展望[J].解放軍醫學雜志，2016,41(2)：87

[7]謝敏，郝好杰，劉杰杰，等.脂肪間充質干細胞促進肝臟糖酵解對2型糖尿病大鼠高血糖的改善作用研究[J].解放軍醫學雜志，2016,41(7)：539

[8]蔣鑫萍，姜新，王瑜，等.自體脂肪間充質干細胞治療放射性肺損傷的應用前景及研究展望[J].吉林大學學報(醫學版),2015,41(3)：662

[9]HESSKE L,VINCENZETTI C,HEIKENWALDER M,et al.Induction of inhibitory central nervous system-derived and stimulatory blood-derived dendritic cells suggests a dual role for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in central nervous system inflammation[J].Brain,2010,133(Pt 6):1637

[10]BREX PA,CICCARELLI O,O′ RIORDAN JI,et al.A longitudinal study of abnormalities on MRI and disability from multiple sclerosis[J].N Engl J Med,2002,346(3):158

[11]TRAPP BD,PETERSON J,RANSOHOFF RM,et al.Axonal transection in the lesions of multiple sclerosis[J].N Engl J Med,1998,338(5):278

[12]GERDONI E,GALLO B,CASAZZA S,et al.Mesenchymal stem cells effectively modulate pathogenic immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].Ann Neurol,2007,61(3):219

[13]GORDON D,PAVLOVSKA G,UNEY JB,et al.Human mesenchymal stem cells infiltrate the spinal cord, reduce demyelination, and localize to white matter lesions in experimental autoimmune encephalomyelitis[J].J Neuropathol Exp Neurol,2010,69(11):1087

[14]MUNOZ JR,STOUTENGER BR,ROBINSON AP,et al.Human stem/progenitor cells from bone marrow promote neurogenesis of endogenous neural stem cells in the hippocampus of mice[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(50):18171

[15]CAPLAN AI,DENNIS JE.Mesenchymal stem cells as trophic mediators[J].J Cell Biochem,2006,98(5):1076

[16]SCUTERI A,CASSETTI A,TREDICI G.Adult mesenchymal stem cells rescue dorsal root ganglia neurons from dying[J].Brain Res,2006,1116(1):75

[17]SCRUGGS BA,SEMON JA,ZHANG X,et al.Age of the donor reduces the ability of human adipose-derived stem cells to alleviate symptoms in the experimental autoimmune encephalomyelitis mouse model[J].Stem Cells Transl Med,2013,2(10):797

[18]MARS LT,GAUTRON AS,NOVAK J,et al.Invariant NKT cells regulate experimental autoimmune encephalomyelitis and infiltrate the central nervous system in a CD1d-independent manner[J].J Immunol,2008,181(4):2321

(2015-12-25收稿 責任編輯王 曼)

Efficacy of adipose mesenchymal stem cell on experimental autoimmune encephalomyelitis mice

XUEPeng1)，LIJinfeng2)，LIUXinshan2)，LIUJin3)，LIUFengjiao3)，QINYaru3)，DUANHaifeng3)，WANGYunliang1)

1)DepartmentofNeurology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014 2)DepartmentofNeurology,the148thPLAHospital,Zibo255300 3)InstituteofRadiationMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100853

multiple sclerosis;adipose mesenchymal stem cell;autoimmune encephalomyelitis;regulatory T cell;mouse

Aim: To observe the efficacy of adipose mesenchymal stem cell(ADMSC) on experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) mice.Methods: At the 0,7th day during the experiment, the mice in EAE group(n=13) and ADMSC group(n=14) were immuned with MOG35-55/CFA emulsion;at the 14th,21st,28th day,ADMSC (5.5×106cells per mouse) were injected via the tail vein in ADMSC group, while normal saline instead of ADMSC were given in EAE group. The control group(n=12) were not immuned or injectd with ADMSC. Nerve function injury scoring was performed during the experiment. At the 33th day, myelin depigmentation and inflammatory cell infiltration score for spinal cord were carried out, TNF-α,IL-17,and IL-4 level in the peripheral blood were evaluated by ELISA,and the percent of CD4+Foxp3+Treg cells were analyzed by flow cytometry. Results: Compared with those of EAE group, nerve function score, myelin depigmentation score and inflammatory cell infiltration score of the ADMSC group significantly decreased(P<0.05); the level of IL-4 increased, while the levels of IL-17 and TNF-α decreased(P<0.05); the percent of CD4+Foxp3+Treg cells significantly increased(P<0.05) and reached to the level of the control group. Conclusion: ADMSC transplantation could effectively improve neural function in experimental autoimmune encephalomyelitis mice.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.011

*國家自然科學基金項目 81201760

R742