HBx基因瞬時轉染對SUDHL-4細胞增殖的影響*

張 艷，彭邦安，程旭芳，柏祥芳，牛 帥，王 寧，馬 方，王慶端

1)河南省(鄭州大學)醫藥科學研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院 鄭州 450001 3)鄭州市中心醫院藥學部 鄭州 450007

?

HBx基因瞬時轉染對SUDHL-4細胞增殖的影響*

張 艷1)△，彭邦安2)，程旭芳3)，柏祥芳2)，牛 帥2)，王 寧1)，馬 方1)，王慶端1)

1)河南省(鄭州大學)醫藥科學研究院 鄭州 450052 2)鄭州大學藥學院 鄭州 450001 3)鄭州市中心醫院藥學部 鄭州 450007

△女，1967年12月生，碩士，副研究員，研究方向：腫瘤藥理，E-mail:zhangyan2008@zzu.edu.cn

HBx基因；脂質體轉染；SUDHL-4細胞；增殖

目的：研究HBx基因瞬時轉染對淋巴瘤細胞SUDHL-4增殖、細胞周期及凋亡的影響。方法：用分子克隆方法構建HBx基因的真核載體pcDNA3.1-X，利用脂質體轉染法將pcDNA3.1-X轉入淋巴瘤細胞SUDHL-4 中，構建整合有 HBx基因的淋巴瘤細胞株SUDHL-4-HBx，以SUDHL-4及轉染空載體的細胞SUDHL-4-con作為對照，利用CCK8法檢測細胞轉染24、48、72和96 h后的增殖活性，繪制生長曲線；應用流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡情況。結果：重組質粒雙酶切結果及測序結果表明成功構建pcDNA3.1-X，轉染后SUDHL-4細胞有HBx mRNA及蛋白的表達。與SUDHL-4組及SUDHL-4-con組相比，SUDHL-4-HBx組細胞的增殖能力下降，G0/G1期細胞比例增加，S期細胞比例減少，凋亡率升高(P<0.05)。結論：瞬時轉染HBx基因后，SUDHL-4細胞增殖減緩，細胞周期阻滯于G0/G1期，凋亡率增加。

惡性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是淋巴結和(或)結外部位淋巴組織的免疫細胞腫瘤，按病理類型分為霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma，HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma, NHL)。在中國，每年新發惡性腫瘤中淋巴瘤約占4%，是第九大常見腫瘤，其在腫瘤導致的死亡排名中居第10位，其中以NHL為主，占ML的85%～90%。在每年新診斷的血液系統腫瘤中，淋巴瘤約占一半[1]。在淋巴瘤患者的治療中，常常發現較多的肝炎病毒陽性患者，兩者的關系日益受到關注。國內外臨床觀察及研究[2-5]提示HBV感染與B細胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)有關，ML的HBV感染率僅次于肝癌。目前HBV感染在NHL發生和進展中的作用尚不清楚。彌漫性大B細胞淋巴瘤(SUDHL-4)是最常見的一種B-NHL，作者采用基因轉染的方法將HBx基因轉入SUDHL-4細胞中，觀察HBV對B-NHL細胞增殖的影響并探討其可能的作用機制，為B-NHL的防治提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞株：SUDHL-4細胞購自ATCC細胞庫。試劑：血液基因組柱式提取試劑盒購自康為世紀公司；膠回收試劑盒購自Qiagen公司；載體克隆試劑盒及DH10B感受態細胞購自中美泰和生物技術公司；無內毒素質粒抽提試劑盒購自康為世紀公司；pcDNA3.1-EGFP質粒購自北京天恩澤基因科技有限公司；EcoRⅠ、HindⅢ及T4連接酶購自NEB公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司；Trizol總RNA提取試劑購自康為世紀公司；細胞凋亡檢測試劑盒及細胞周期檢測試劑盒購自凱基生物有限公司。

1.2 HBx基因的提取、制備 利用血液基因組柱式提取試劑盒提取HBV感染者血清的基因組DNA，根據GenBank中HBx基因全序列設計擴增引物，上游5’-ATGCAAGCTTATGGCTGCTAGGCTG TACTG-3’，下游5’-TGCGAATTCTTAGGCAGAGGT GAAAAAGTTG-3’。以上述HBV基因組DNA為模版，PCR擴增目的基因，產物在20 g/L的瓊脂糖凝膠上電泳，觀察電泳結果。

1.3 HBx基因測序載體構建 利用膠回收試劑盒膠回收目的片段，并用紫外分光光度計測定DNA濃度及純度。利用載體克隆試劑盒將目的基因連接在pCloneEZ-TA-Amp/HC載體上后轉化DH10B感受態細胞，經氨芐青霉素篩選出陽性菌落后擴大培養，提取質粒，PCR擴增產物經凝膠電泳鑒定，并取陽性菌落測序鑒定。

1.4 HBx基因真核載體構建 根據pCloneEZ-TA-Amp/HC載體及pcDNA3.1-EGFP載體的酶切位點，選用限制性內切酶HindⅢ和限制性內切酶EcoRⅠ進行雙酶切，利用 T4連接酶將兩目的片段連接成重組質粒后轉化感受態細胞，經氨芐青霉素篩選出陽性單菌落，挑選克隆后提取質粒，凝膠電泳及測序鑒定。

1.5 HBx基因轉染 將SUDHL-4細胞接種于含Opti-MEMⅠ無血清培養基的6孔板中，利用Lipofectamine 2000將重組質粒轉入細胞，命名為SUDHL-4-HBx組，同時設空白對照組及轉染空載體對照組，分別命名為SUDHL-4組和SUDHL-4-con組，每組3個復孔，在37 ℃、體積分數5% CO2的培養箱中培養48 h后利用熒光顯微鏡觀察轉染情況及細胞狀態。

1.6 RT-PCR檢測HBx mRNA表達 轉染48 h后利用Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，使用紫外分光光度計測定總RNA的純度和濃度，并通過凝膠電泳進行RNA完整性測定。逆轉錄反應合成cDNA鏈后通過RT-PCR擴增HBx基因，在465 bp處出現條帶則表明HBx基因在SUDHL-4細胞中成功表達。

1.7 Western bolt 檢測HBx 蛋白表達 轉染48 h后收集各組細胞，利用RIPA Buffer裂解液提取各組細胞總蛋白，取20 μL蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并在恒流200 mA、冰水浴條件下電轉60 min轉移至PVDF膜上，50 g/L的脫脂奶液封閉液完全封閉1 h，以封閉液按11 000稀釋HBx抗體，將上述PVDF膜浸泡其中孵育3 h后用TBST溶液洗膜，然后與18 000稀釋的二抗孵育1 h后利用ECL試劑發光顯色，在17 000處出現條帶則表明HBx蛋白在SUDHL-4細胞中成功表達。

1.8 CCK8法檢測細胞增殖活性 取3組細胞以1×107L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，培養24、48、72、96 h后每孔加入10 μL CCK8試劑，4 h后在450 nm波長下檢測各孔OD值，重復3次取均值。以OD值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.9 流式細胞儀檢測細胞周期 收集轉染48 h后的3組細胞，用冷PBS洗滌細胞后加入體積分數70%冷乙醇固定過夜。用流式細胞儀進行檢測，采用Cell Quest軟件分析細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.10 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集轉染48 h后的3組細胞，于染色前用預冷的PBS洗滌細胞并離心，按 AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒說明書操作，于1 h內上流式細胞儀檢測，用Cell Quest軟件分析細胞凋亡情況，計算細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.11 統計學處理 采用SPSS 21.0進行數據分析。不同組間細胞凋亡率和細胞周期的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 HBx基因的制備 PCR結果見圖1。可見464 bp的目的片段，與預期相符。

1：DNA Marker；2：HBx基因陽性表達；3：對照。圖1 PCR擴增HBx基因結果

2.2 HBx基因真核載體鑒定 凝膠電泳結果(圖2)和測序結果顯示成功構建HBx基因真核載體。紫外分光光度計測定重組質粒的濃度為0.145 g/L，其OD260 nm/OD280 nm為1.82，表明重組質粒有較高的濃度和純度，可進行下一步實驗。

1：DM10000 DNA Marker；2：pcDNA3.1；3：pcDNA3.1-X；4：100 bp DNA Marker。圖2 重組質粒雙酶切鑒定結果

2.3 轉染HBx后細胞形態變化 轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察SUDHL-4細胞的形態變化情況，發現轉染后細胞發生皺縮，且可以觀察到綠色熒光，見圖3。

A:SUDHL-4組；B:SUDHL-4-con組；C:SUDHL-4-HBx組。圖3 熒光顯微鏡下細胞轉染情況(×200)

2.4 HBx mRNA的表達 紫外分光光度計測得3組細胞總RNA均有較高的濃度和純度。將各組總RNA進行凝膠電泳實驗，其中28S處亮度大約為18S處亮度的2倍，即各組總RNA完整性較好，可進行下一步實驗。將PCR擴增產物進行凝膠電泳，可見SUDHL-4-HBx組有目的片段出現，而其他2組未見mRNA的表達，見圖4。

1：DNA Marker；2：SUDHL-4-HBx組；3：SUDHL-4組；4：SUDHL-4-con組。圖4 PCR產物凝膠電泳結果

2.5 HBx蛋白的表達 Western bolt 結果顯示SUDHL-4-HBx組在17 000處有蛋白條帶(即HBx蛋白)，而SUDHL-4組和SUDHL-4-con組未見表達，見圖5。

A:SUDHL-4組；B:SUDHL-4-con組；C:SUDHL-4-HBx組。圖5 3組細胞中HBx蛋白的表達

2.6 轉染HBx后各組細胞的生長曲線 與其他2組比較，SUDHL-4-HBx組細胞增殖減緩，見圖6。

圖6 瞬時轉染HBx基因對SUDHL-4細胞增殖的影響

2.7 轉染HBx后各組細胞凋亡率和細胞周期 SUDHL-4-HBx組與其他2組相比，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少，細胞凋亡率增加，見表1。

表1 瞬時轉染HBx后 各組細胞周期及凋亡率比較(n=3) %

*：與其他2組相比,P<0.05。

3 討論

淋巴瘤的病因與發病機制很復雜[6]，其中病毒的慢性感染在淋巴瘤的發生過程中起重要作用，如EB病毒感染和淋巴瘤的關系已經得到充分證實。HBV是一種嗜肝細胞病毒，而且還具有較強的親淋巴細胞特性，和B細胞來源的淋巴瘤有關。大量的臨床研究[2-5]也表明NHL患者HBV感染率明顯高于普通人群及其他實體腫瘤患者，ML HBV的感染率僅次于肝癌；同時HBV的再激活在NHL合并HBV感染患者的治療中表現突出，這充分表明HBV感染與淋巴瘤的發生有一定的相關性。

HBx蛋白是一種多功能蛋白，對細胞的凋亡具有雙向調控作用，可因其細胞類型、HBV感染階段、細胞因子及干預因素等的不同而表現出促進或者抑制細胞凋亡兩種不同的作用。HBx基因誘導細胞凋亡可能主要通過以下幾種途徑進行：上調c-myc的表達，使細胞對TNF-α介導的凋亡信號敏感[7]；拮抗Bcl-2的凋亡抑制作用；與DDB1競爭性結合DDB2，以DDB1非依賴形式介導細胞凋亡[8]；定位線粒體膜，和電壓依賴的離子通道蛋白結合，使線粒體跨膜電壓下降，誘導細胞凋亡因子的釋放及誘導氧自由基的損傷等[9]。

該實驗利用脂質體轉染法將HBx基因導入SUDHL-4細胞中，結果顯示脂質體轉染48 h后SUDHL-4-HBx組細胞有HBx mRNA和蛋白的表達。瞬時轉染HBx基因后淋巴瘤細胞增殖減緩，在G0/G1期發生細胞阻滯，細胞凋亡率顯著增加。

病毒感染宿主細胞后，病毒蛋白引發細胞凋亡是病毒感染過程中的普遍現象[10-11]；HBx基因誘導細胞凋亡的作用可促使細胞免疫逃逸；加強細胞再生反應，促進HBV的細胞感染；還可降低機體抗炎反應，促進病毒的擴散[12]，這都表明HBx基因誘導凋亡的作用也可促進細胞惡性轉化。瞬時轉染實驗可揭示HBV感染初期HBx基因對淋巴瘤細胞可能的作用機制，為下一步研究穩定表達HBx基因對SUDHL-4細胞的影響提供參考依據。

[1]劉志剛,徐才剛.淋巴瘤的發病現狀與危險因素[J].西部醫學,2013,25(7):961

[2]MARCUCCI F,MELE A.Hepatitis viruses and non-Hodgkin lymphoma:epidemiology, mechanisms of tumorigenesis, and therapeutic opportunities[J].Blood,2011,117(6):1792

[3]CHEN J,WANG J,YANG J,et al.Concurrent infection of hepatitis B virus negatively affects the clinical outcome and prognosis of patients with non-Hodgkin′s lymphoma after chemotherapy[J].PLoS One,2013,8(7):e69400

[4]DALIA S,CHAVEZ J,CASTILLO JJ,et al.Hepatitis B infection increases the risk of non-Hodgkin lymphoma:a meta-analysis of observational studies[J].Leuk Res,2013,37(9):1107

[5]鄭丹,王樹葉,王巍,等.257例非霍奇金淋巴瘤患者乙型肝炎病毒感染分析[J].醫學綜述,2012,18(13):2119

[6]高怡瑾.兒童非霍奇金淋巴瘤的診斷與治療[J].實用兒科臨床雜志,2012,27(3):160

[7]SHUKLA SK,KUMAR V.Hepatitis B virus X protein and c-Myc cooperate in the upregulation of ribosome biogenesis and in cellular transformation[J].FEBS J,2012,279(20):3859

[8]JIANG T,LIU M,WU J,et al.Structural and biochemical analysis of Bcl-2 interaction with the hepatitis B virus protein HBx[J].Proc Natl Acad Sci USA,2016,113(8):2074

[9]LEE YI,HWANG JM,IM JH,et al.Human hepatitis B virus-X protein alters mitochondrial function and physiology in human liver cells[J].J Biol Chem,2004,279(15):15460

[10]RAJPUT P,SHUKLA SK,KUMAR V.The HBx oncoprotein of hepatitis B virus potentiates cell transformation by inducing c-Myc-dependent expression of the RNA polymerase Ⅰ transcription factor UBF[J].Virol J,2015,12:62

[11]趙曉彪,李光耀,劉孟剛,等.Tmub1過表達及沉默慢病毒載體轉染對大鼠BRL-3A肝細胞增殖的影響[J].解放軍醫學雜志,2016,41(1):12

[12]白洋祿.乙型肝炎病毒感染與淋巴瘤關系的研究[D].南寧:廣西醫科大學,2014.

(2016-07-28收稿 責任編輯姜春霞)

Effects of HBx gene transient transfection on proliferation of SUDHL-4 cells

ZHANGYan1),PENGBang′an2),CHENGXufang3),BAIXiangfang2),NIUShuai2),WANGNing1),MAFang1),WANGQingduan1)

1)HenanAcademyofMedicalandPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052 2)CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 3)DepartmentofPharmacy,ZhengzhouCentralHospital,Zhengzhou450007

HBx gene;lipofection transfection;SUDHL-4 cell;proliferation

Aim: To investigate the effects of HBx transient transfection on proliferation, cell cycle and apoptosis in lymphoma cell SUDHL-4. Methods: The HBx eukaryon expression vector pcDNA3.1-X was established through recombi nation DNA technique. The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X and empty vector pcDNA3.1 were transfected into SUDHL-4 cells which were named SUDHL-4-HBx and SUDHL-4-con. Untransfected SUDHL-4 and SUDHL-4-con were used as control. The CCK8 experiment was performed to detect the reproductive ability of cells in 24, 48, 72 and 96 h,and growth curves were obtained. Cell apoptosis and cell cycle were detected by flow cytometry. Results: The reconstituted plasmid pcDNA3.1-X was identified by restriction enzyme digestion and nucleotide sequencing, the expressions of HBx mRNA and protein were confirmed in the SUDHL-4 cells transfected with HBx. Compared with SUDHL-4 group and SUDHL-4-con group, the proliferative capacity of cells in SUDHL-4-HBx group was obviously decreased. Flow cytometry analysis showed that HBx transfection significantly increased G0/G1phase proportion and cell apoptosis rate when comparing with SUDHL-4 and SUDHL-4-con groups(P<0.05). Conclusion: HBx transient transfection could inhibit SUDHL-4 cell proliferation by blocking cell cycle in G0/G1phase and increasing cell apoptosis.

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.007

*河南省重點科技攻關計劃項目 142102310085

R733.4