基因工程T細(xì)胞的臨床研究進(jìn)展*

高俊芳，李 峰，王麗萍，張 毅

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

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基因工程T細(xì)胞的臨床研究進(jìn)展*

高俊芳1)，李 峰2)，王麗萍1)，張 毅1,2,3)#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者，男，1964年4月生，博士，教授，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤免疫，E-mail：yizhang@zzu.edu.cn

免疫治療；基因工程T細(xì)胞；TCR-T細(xì)胞；CAR-T細(xì)胞

盡管手術(shù)和放化療等傳統(tǒng)治療手段在腫瘤治療方面取得了很大進(jìn)展，但在改善腫瘤患者預(yù)后和生存等方面仍不令人滿意。近年來，腫瘤免疫治療領(lǐng)域發(fā)展迅速，出現(xiàn)了多種效果良好的免疫治療藥物和技術(shù)[1-6]。免疫治療已經(jīng)成為腫瘤綜合治療的重要手段，甚至在不久后有可能成為腫瘤治療的主要手段。在這些免疫治療新技術(shù)中，基因工程T細(xì)胞的發(fā)展尤為令人矚目[7]。多項(xiàng)臨床研究[8-11]顯示，基因工程T細(xì)胞能夠有效清除機(jī)體內(nèi)惡性細(xì)胞，甚至能夠長(zhǎng)期緩解病情。該文將介紹基因工程T細(xì)胞的臨床研究進(jìn)展，并探討該領(lǐng)域在中國(guó)的發(fā)展。

1 基因工程T細(xì)胞的主要類型

目前，臨床研究中最重要的基因工程T細(xì)胞是T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)改造的T細(xì)胞(TCR-T細(xì)胞)和嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor, CAR)T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)。TCR-T和CAR-T細(xì)胞均通過識(shí)別腫瘤抗原來殺傷腫瘤細(xì)胞，但是二者在受體結(jié)構(gòu)和抗原識(shí)別方面存在很大差異。TCR-T細(xì)胞中僅轉(zhuǎn)導(dǎo)了TCR的α鏈與β鏈，轉(zhuǎn)導(dǎo)的TCR依賴細(xì)胞內(nèi)CD3和CD28等分子傳導(dǎo)信號(hào)，最終激活T細(xì)胞[12]。TCR構(gòu)建相對(duì)復(fù)雜，既需要考慮主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)類型，又需要對(duì)復(fù)雜的α鏈與β鏈亞型進(jìn)行鑒定，最后才能獲得特異TCR序列。而CAR中不僅含有識(shí)別腫瘤抗原的單鏈抗體(single chain antibody fragment, scFv)序列，更重要的是含有胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)[13]，因此，CAR能夠以非MHC依賴性的方式識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面抗原，并直接激活T細(xì)胞。另外，CAR序列的構(gòu)建相對(duì)容易，可變區(qū)僅是scFv，其他部分均是保守的已知序列。在CAR-T細(xì)胞研究方面，目前的熱點(diǎn)主要是測(cè)試不同信號(hào)分子組合對(duì)T細(xì)胞功能的影響。由于具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、作用直接等優(yōu)點(diǎn)，CAR-T細(xì)胞是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)，尤其在血液腫瘤方面，CAR-T細(xì)胞臨床研究的報(bào)道非常多，并且取得了令人滿意的效果。與CAR-T細(xì)胞相比，TCR-T細(xì)胞在治療靶向性以及實(shí)體瘤治療方面具有優(yōu)勢(shì)。TCR-T和CAR-T細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)差異改編自文獻(xiàn)[14]，見圖1；二者在抗原識(shí)別方面的差異見表1。

圖1 TCR-T(左)和CAR-T(右)細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)的差異表1 TCR-T和CAR-T細(xì)胞在抗原識(shí)別方面的差異

細(xì)胞類型受體結(jié)構(gòu)MHC依賴性抗原定位體內(nèi)擴(kuò)增TCR-T細(xì)胞含TCRα鏈和β鏈依賴細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原依賴于抗原遞呈細(xì)胞擴(kuò)增CAR-T細(xì)胞含抗原特異性scFv以及CD3-CD28等信號(hào)分子功能結(jié)構(gòu)非依賴細(xì)胞表面抗原存在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,自主復(fù)制

2 TCR-T細(xì)胞的臨床研究

TCR是表達(dá)于T細(xì)胞表面的異二聚體蛋白分子，能夠識(shí)別和結(jié)合特異抗原肽-MHC并介導(dǎo)免疫應(yīng)答。通過基因工程技術(shù)，將識(shí)別腫瘤特異抗原-MHC的TCR轉(zhuǎn)導(dǎo)至體外擴(kuò)增的T細(xì)胞中，就能夠產(chǎn)生大量具有腫瘤特異殺傷能力的TCR-T細(xì)胞。目前，TCR-T細(xì)胞的臨床研究主要在實(shí)體瘤治療中開展，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療方面僅有少量研究報(bào)道[10,15]。其中，TCR-T細(xì)胞在多發(fā)性骨髓瘤治療中效果顯著，70%的患者(研究中共納入20位患者)完全緩解，1位患者疾病進(jìn)展，其余患者或部分緩解或疾病穩(wěn)定。下面就TCR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)單介紹。

TCR-T細(xì)胞臨床研究開始的標(biāo)志是2006年的兩項(xiàng)關(guān)于治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的臨床研究報(bào)道。其中，Duval等[16]利用黑色素瘤分化抗原MART-1特異性TCR-T細(xì)胞治療了15例患者，盡管僅有1例患者出現(xiàn)了部分緩解，但該報(bào)道證明TCR-T細(xì)胞對(duì)人體是安全的。隨后，Morgan等[17]采用MART-1特異性TCR-T細(xì)胞治療15例患者，發(fā)現(xiàn)體外擴(kuò)增的TCR-T細(xì)胞能夠在患者體內(nèi)長(zhǎng)期存活(檢測(cè)時(shí)已達(dá)2個(gè)月)，甚至在2例患者中高水平持續(xù)了1 a之久，并且這2例患者出現(xiàn)了客觀緩解。此后，隨著TCR-T細(xì)胞研究的深入，科學(xué)家認(rèn)識(shí)到TCR親和性與治療效果緊密相關(guān)。當(dāng)使用高親和力TCR-T細(xì)胞時(shí)，患者緩解率大幅上升。Johnson等[18]使用MART-1高親和力TCR-T細(xì)胞對(duì)20例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者進(jìn)行了治療，客觀緩解率達(dá)到30%。另一個(gè)影響TCR-T細(xì)胞治療效果的重要因素是特異性抗原在腫瘤中的表達(dá)。抗原表達(dá)越廣泛，則特異性TCR-T細(xì)胞治療效果越好。一個(gè)典型例子是癌睪抗原NY-ESO-1。NY-ESO-1在腫瘤中的表達(dá)十分普遍。Robbins等[11,19]觀察了NY-ESO-1特異性TCR-T細(xì)胞治療黑色素瘤和滑膜肉瘤的效果，結(jié)果顯示55%黑色素瘤患者及61%滑膜肉瘤患者獲得了臨床緩解，黑色素瘤患者的3 a及5 a生存率均達(dá)到33%，滑膜肉瘤患者的3 a及5 a生存率分別達(dá)到了38%和14%。由于TCR-T細(xì)胞需要共刺激信號(hào)才能活化增殖，因此，樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)能夠增強(qiáng)TCR-T細(xì)胞的治療效果。Chodon等[20]采用DC疫苗聯(lián)合MART-1特異性TCR-T細(xì)胞治療14例轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，結(jié)果顯示高達(dá)69%的患者明顯好轉(zhuǎn)。

在TCR-T細(xì)胞治療的發(fā)展過程中，Steven Rosenberg做出了巨大貢獻(xiàn)。Steven Rosenberg是腫瘤免疫治療的代表人物，他的工作推動(dòng)了包括腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、TCR-T細(xì)胞和CAR-T細(xì)胞在內(nèi)的過繼性細(xì)胞治療的進(jìn)步。特別是在TCR-T細(xì)胞治療領(lǐng)域，多數(shù)臨床研究報(bào)道來自Steven Rosenberg團(tuán)隊(duì)。近期，Steven Rosenberg又引領(lǐng)了細(xì)胞治療領(lǐng)域的突破，他的團(tuán)隊(duì)鑒定了識(shí)別腫瘤新抗原的CD4+T細(xì)胞，利用這些細(xì)胞治療后腫瘤明顯縮小[21]。這項(xiàng)研究突顯了新抗原在腫瘤治療中的重要性，奠定了新抗原作為基因工程T細(xì)胞治療靶點(diǎn)的研究基礎(chǔ)。更加值得注意的是，Steven Rosenberg創(chuàng)新了傳統(tǒng)TCR構(gòu)建方案，使利用外周血T細(xì)胞構(gòu)建腫瘤抗原特異性TCR成為現(xiàn)實(shí)[22]，這將進(jìn)一步加速TCR-T細(xì)胞的研究進(jìn)展。

3 CAR-T細(xì)胞的臨床研究

從CAR概念的提出，至今已經(jīng)20余年。CAR結(jié)構(gòu)從含單一信號(hào)分子到現(xiàn)在含有3個(gè)甚至更多信號(hào)調(diào)控分子。對(duì)CAR結(jié)構(gòu)的改造成功提高了T細(xì)胞活性與體內(nèi)存活時(shí)間，為CAR-T細(xì)胞的臨床應(yīng)用奠定了良好基礎(chǔ)[3,23]。目前，該領(lǐng)域的研究進(jìn)展集中在CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療惡性血液病方面[8, 24-26]。CD19是一個(gè)良好的血液系統(tǒng)腫瘤治療靶點(diǎn)，表達(dá)于幾乎全部B細(xì)胞性惡性腫瘤上，但在正常細(xì)胞中，僅成熟B細(xì)胞、前體B細(xì)胞以及部分DC細(xì)胞表達(dá)CD19。更為重要的是造血干細(xì)胞不表達(dá)CD19，因而攻擊CD19靶點(diǎn)不會(huì)影響患者的正常造血功能。

在CAR-T細(xì)胞的發(fā)展中，Carl June是一位里程碑式人物，他的系統(tǒng)工作為CAR-T細(xì)胞治療突破鋪平了道路。Carl June團(tuán)隊(duì)首先證實(shí)了利用病毒表達(dá)系統(tǒng)改造的CAR-T細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)能夠長(zhǎng)期存活，并且攜帶異源基因的T細(xì)胞對(duì)機(jī)體無(wú)害[27]。Carl June團(tuán)隊(duì)還觀察了CD19特異性CAR-T細(xì)胞在多種血液系統(tǒng)腫瘤中的治療效果。2011年，Carl June團(tuán)隊(duì)報(bào)道了CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療晚期慢性淋巴細(xì)胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)的臨床研究結(jié)果[24-25]。輸入的CAR-T細(xì)胞能夠在患者體內(nèi)長(zhǎng)期存活并發(fā)揮功能，通過清除外周血和骨髓中的惡性細(xì)胞，幫助重建正常免疫系統(tǒng)，最終帶來病情的長(zhǎng)期緩解(觀察時(shí)已經(jīng)達(dá)到10個(gè)月)。隨后，Carl June團(tuán)隊(duì)又報(bào)道了CD19特異性CAR-T細(xì)胞治療復(fù)發(fā)急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)的臨床研究結(jié)果[9,26]。與CLL治療效果類似，CAR-T細(xì)胞同樣能夠在ALL患者體內(nèi)長(zhǎng)效清除惡性細(xì)胞，持續(xù)緩解病情(在部分患者中觀察到至少11個(gè)月的持續(xù)緩解)。更令人振奮的是，90%患者的病情在CAR-T細(xì)胞治療后完全緩解。此外，Carl June團(tuán)隊(duì)還證實(shí)CAR-T細(xì)胞治療對(duì)難治性多發(fā)性骨髓瘤同樣有效[28]。除了Carl June團(tuán)隊(duì)的工作外，還有多項(xiàng)研究[29-31]結(jié)果支持CAR-T細(xì)胞治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效性。Brentjens等[32]的工作也進(jìn)一步證實(shí)CAR-T細(xì)胞在CLL和ALL治療中的有效性。而Kochenderfer等[33]則發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞在淋巴瘤治療中也非常有效。除了CD19外，CD33也是血液系統(tǒng)腫瘤治療的靶點(diǎn)[34]，但相關(guān)報(bào)道較少，尚需更多研究來驗(yàn)證CD33特異性CAR-T細(xì)胞治療的有效性。

與在血液系統(tǒng)腫瘤治療中取得的成就相比，CAR-T細(xì)胞治療實(shí)體瘤的臨床研究結(jié)果不是十分理想。2006年，Lamers等[35]觀察了靶向碳酸酐酶Ⅸ的CAR-T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的效果。改造的CAR-T細(xì)胞可以在患者體內(nèi)存活7周但沒有明顯的治療作用。這項(xiàng)研究作為CAR細(xì)胞治療實(shí)體瘤的先驅(qū)具有開拓性意義。之后的幾項(xiàng)臨床研究[36-37]也都證實(shí)CAR-T細(xì)胞能夠在實(shí)體瘤患者體內(nèi)生存較長(zhǎng)時(shí)間(最長(zhǎng)達(dá)到192周)，且沒有明顯毒副作用，但是也未能顯著緩解病情。韓為東的團(tuán)隊(duì)[38]觀察了靶向EGFR的CAR-T細(xì)胞治療EGFR陽(yáng)性的復(fù)發(fā)或難治性非小細(xì)胞肺癌的效果，結(jié)果未出現(xiàn)嚴(yán)重毒副作用，且治療后EGFR轉(zhuǎn)陰，但臨床效果并不十分明顯。值得注意的是，Ahmed等[39]在難治性肉瘤患者中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈輸入的相當(dāng)一部分CAR-T細(xì)胞能夠到達(dá)腫瘤病灶，并在腫瘤中擴(kuò)增；與此觀察一致的是，腫瘤組織出現(xiàn)了大面積壞死，然而腫塊沒有明顯縮小，患者沒有顯著臨床反應(yīng)。結(jié)合TCR-T細(xì)胞的臨床研究經(jīng)驗(yàn)，這個(gè)結(jié)果提示在面對(duì)異質(zhì)性程度更高的實(shí)體瘤時(shí)，要采用針對(duì)不同靶點(diǎn)的基因工程T細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞和TCR-T細(xì)胞)來聯(lián)合治療，同時(shí)要盡可能降低腫瘤負(fù)荷，這樣才能取得好的治療效果。

4 基因工程T細(xì)胞治療中存在的問題

基因工程T細(xì)胞展示出強(qiáng)大的腫瘤清除能力，但也存在很多問題，例如，生產(chǎn)成本高、T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)難和特異性細(xì)胞純度不一致等。其中，影響治療安全的因素主要是脫靶效應(yīng)和細(xì)胞因子釋放綜合征(cytokine releasing syndrome,CRS)[8-9,40]。前者產(chǎn)生的原因是基因工程T細(xì)胞識(shí)別的抗原往往不是腫瘤細(xì)胞獨(dú)有的，部分正常組織也表達(dá)這些抗原，這就導(dǎo)致基因工程T細(xì)胞也會(huì)攻擊正常細(xì)胞。在TCR-T細(xì)胞治療研究中，曾發(fā)現(xiàn)脫靶效應(yīng)會(huì)帶來嚴(yán)重腸炎和心臟毒性，并曾導(dǎo)致部分患者死亡[41-42]。而在CAR-T細(xì)胞治療研究中，最典型的例子是CD19特異性T細(xì)胞攻擊正常B細(xì)胞，使患者發(fā)生低丙種球蛋白血癥[43]。為了解決這一問題，科學(xué)家設(shè)計(jì)了分子開關(guān)來調(diào)節(jié)基因工程T細(xì)胞活性，希望將脫靶效應(yīng)的影響降至最低。另外，針對(duì)腫瘤新抗原設(shè)計(jì)基因工程T細(xì)胞可能有助于更徹底地解決脫靶問題[44]。另外一個(gè)基因工程T細(xì)胞治療的主要副作用——CRS的產(chǎn)生主要是由于基因工程T細(xì)胞過于強(qiáng)大的腫瘤殺傷能力，使機(jī)體短時(shí)間內(nèi)釋放大量促炎性因子，導(dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)熱、皮疹，器官衰竭，甚至死亡等[43，45]。但是隨著對(duì)基因工程T細(xì)胞作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)加深，通過控制細(xì)胞注射數(shù)量已經(jīng)能夠很好地防止CRS的發(fā)生。相信隨著研究的進(jìn)一步深入，CRS將不再是基因工程T細(xì)胞治療的限制因素。

5 中國(guó)科研人員的工作

近年來，中國(guó)科研人員在腫瘤免疫治療基礎(chǔ)研究方面也取得了許多成果[46-47]。在基因工程T細(xì)胞治療研究領(lǐng)域，中國(guó)科技人員開展了廣泛而深入的研究，并做出了相應(yīng)貢獻(xiàn)。在CAR-T細(xì)胞領(lǐng)域，解放軍301醫(yī)院的韓為東教授做出了代表性工作，他的團(tuán)隊(duì)觀察了針對(duì)不同抗原(CD19、CD20和CD33)的CAR-T細(xì)胞對(duì)白血病和淋巴瘤患者的治療效果[34,48-49]，拓寬了CAR-T細(xì)胞的應(yīng)用范圍。更加令人欣喜的是，根據(jù)公開數(shù)據(jù)，半數(shù)以上注冊(cè)的CAR-T細(xì)胞臨床研究由中國(guó)科學(xué)家或公司主導(dǎo)，這說明中國(guó)在CAR-T細(xì)胞研究和治療方面已經(jīng)處于世界前列。在TCR-T細(xì)胞方面，目前尚未見國(guó)內(nèi)的相關(guān)臨床研究報(bào)道，但是根據(jù)ClinicalTrials.gov數(shù)據(jù)，中國(guó)境內(nèi)已經(jīng)開始了多項(xiàng)TCR-T細(xì)胞的臨床研究。作者所在的實(shí)驗(yàn)室也開展了基因工程T細(xì)胞方面的工作：構(gòu)建了針對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤和實(shí)體瘤不同抗原的CAR-T細(xì)胞，并研究了這些細(xì)胞單獨(dú)或聯(lián)合治療的效果；利用誘導(dǎo)型自殺基因來提高基因工程T細(xì)胞治療的安全性，并在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了較佳效果；構(gòu)建了病毒相關(guān)腫瘤抗原與癌睪抗原高親和力TCR序列庫(kù)，臨床前研究顯示這些高親和力TCR在介導(dǎo)T細(xì)胞清除實(shí)體瘤時(shí)具有很好的效果，為基因工程T細(xì)胞的臨床研究打下了基礎(chǔ)。

6 展望

盡管基因工程T細(xì)胞治療還存在種種問題，但是我們更應(yīng)該注意到該類治療的巨大潛力。據(jù)報(bào)道[50]CAR-T細(xì)胞治療晚期或者難治性白血病的完全緩解率達(dá)到94%。這個(gè)結(jié)果非常振奮人心，也進(jìn)一步證明了基因工程T細(xì)胞的巨大潛力。隨著腫瘤免疫學(xué)和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，基因工程T細(xì)胞治療將更加個(gè)體化。目前，基因工程T細(xì)胞主要針對(duì)“通用靶點(diǎn)”進(jìn)行治療，這就導(dǎo)致部分患者治療反應(yīng)不佳或者無(wú)反應(yīng)。但是，如果能夠根據(jù)患者的腫瘤特異新抗原設(shè)計(jì)個(gè)體化基因工程T細(xì)胞，同時(shí)與靶向腫瘤免疫微環(huán)境的免疫檢查點(diǎn)抑制劑等相結(jié)合，將極大地提高治療有效性和安全性。總而言之，基因工程T細(xì)胞將在腫瘤治療中發(fā)揮越來越重要的作用，它的發(fā)展將為腫瘤患者帶來更多希望。

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(2016-06-08收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

特約述評(píng)作者簡(jiǎn)介

張毅，教授、博士研究生導(dǎo)師、河南省特聘教授；鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心主任；河南省腫瘤免疫治療工程研究中心主任、河南省腫瘤免疫和生物治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任；比利時(shí)魯汶大學(xué)腫瘤免疫學(xué)博士；國(guó)際細(xì)胞生物研究所和Ludwig癌癥研究所布魯塞爾分所博士后；美國(guó)芝加哥大學(xué)研究型助理教授、南卡醫(yī)科大學(xué)助理教授和腫瘤免疫研究室主任。主持過美國(guó)癌癥研究所、美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)、美國(guó)NIH、國(guó)家自然科學(xué)基金面上和國(guó)際合作項(xiàng)目以及衛(wèi)生部重點(diǎn)攻關(guān)等基金項(xiàng)目；發(fā)表論文160余篇，其中SCI論文72篇，被引用1 500余次。中國(guó)醫(yī)藥質(zhì)量管理學(xué)會(huì)細(xì)胞治療質(zhì)量管理和研究分會(huì)常務(wù)副主任委員、中國(guó)研究型醫(yī)院生物治療學(xué)分會(huì)副主任委員、中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù)協(xié)會(huì)精準(zhǔn)醫(yī)療分會(huì)常委、河南省免疫學(xué)會(huì)和河南省抗癌學(xué)會(huì)生物治療專業(yè)委員會(huì)主任委員。

10.13705/j.issn.1671-6825.2016.06.001

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 81171986,81271815；衛(wèi)生部科研資助金 201501004