狐貍腦炎型鏈球菌的分離鑒定與藥敏試驗

秦緒偉 宋竹青

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狐貍腦炎型鏈球菌的分離鑒定與藥敏試驗

秦緒偉 宋竹青

（齊魯動物保健品有限公司 山東濟南 250100）（山東省威海乳山市動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

本試驗從乳山一特種養(yǎng)殖場神經(jīng)癥狀發(fā)病狐貍腦膜分離分離到一株致病性細菌，經(jīng)一系列臨床觀察、實驗室解剖、細菌分離、鑒定、生化試驗確診為肺炎鏈球菌，經(jīng)動物實驗確定該鏈球菌有一定的致病性，經(jīng)藥敏試驗使用藥敏敏感藥物治療，最終控制住病情。由于鏈球菌是環(huán)境常在菌，且有許多不致病，在防控和治療上常被忽視，特別是鏈球菌引起癱瘓癥狀時，常被診斷為缺鈣耽誤治療而死亡，本實驗室是從神經(jīng)癥狀狐貍腦分離到的細菌，有一定的疾病診斷意義和臨床指導意義。

狐貍 鏈球菌神經(jīng)癥狀癱瘓 鑒定

肺炎鏈球菌又稱肺炎雙球菌，是鏈球菌科、鏈球菌屬的成員，鏈球菌屬有18群30多種。鏈球菌在自然界中廣泛分布，有的可以感染人，成為人獸共患病[1]，有的是腦炎球菌又稱腦炎鏈球菌，屬于革蘭氏陽性球菌中鏈球菌屬[2]，可引起各種動物的大葉性腦炎或者腦膜炎，亦可致幼獸腦炎或者敗血癥[3]，狐貍上發(fā)病有敗血性、腦膜腦炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎[4]，臨床上以肺炎型發(fā)病較多，腦炎會見到急性發(fā)病案例，肺炎球菌在多種健康動物的呼吸道、口腔黏膜可以分離到，一般不作為致病菌，只有條件惡劣機體抵抗力差的時候才會發(fā)病。

此次狐貍養(yǎng)殖場發(fā)生急性死亡、口吐白沫、角弓反張、癱瘓為主的病例，從狐貍腦膜分離到致病菌經(jīng)診斷確診為腦炎型肺炎鏈球菌病。開始以為是由于腺病毒引起的狐貍腦炎，經(jīng)調(diào)查注射過狐貍腦炎疫苗，后經(jīng)PCR檢測排除病毒性腦炎病毒，確診后經(jīng)治療恢復正常。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株 來自于山東乳山一狐貍養(yǎng)殖場，養(yǎng)殖狐貍600只，50~70日齡狐貍分窩后零星發(fā)病，發(fā)病半月，死亡7只，主要癥狀口吐白沫、角弓反張、癱瘓，發(fā)病狐貍經(jīng)解剖無菌條件分離腦膜，獲得一株細菌，作為試驗菌株。

1.1.2 試驗動物 18~22g小白鼠7只，購自山東省實驗動物中心；1.5~2.0kg家兔4只，購自濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心；70日齡狐貍4只，購自章丘航科特種毛皮動物養(yǎng)殖場。

1.1.3 試驗材料 營養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、馬丁肉湯、厭氣肉肝湯等培養(yǎng)基等購自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑公司；胎牛血清購自濟南勁牛生物科技有限公司；兔血清采自動物房實驗健康兔；微量生化試劑管購自北京路橋技術(shù)有限責任公司； PCR試劑購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.4 試驗器具 超凈臺、解剖臺、天平、搖床、恒溫培養(yǎng)箱、顯微鏡、研磨儀、解剖剪刀、酒精燈、接種環(huán)、燒杯、試管、平皿等其他實驗室常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 分離細菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 無菌條件下打開發(fā)病狐貍的顱腔，切開后在血清營養(yǎng)瓊脂涂抹，在37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h~24h，觀察細菌菌落，將分離菌單個接種于血清營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、SS瓊脂、鮮血平板，劃線培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18h~24h觀察生長情況。取血清平板上典型的單個菌落，接種馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18~24h，進行革蘭氏染色，油鏡鏡檢。

1.2.2 分離細菌的生化試驗 將分離菌接種于加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫搖床震蕩培養(yǎng)18~24h，取0.2ml細菌馬丁肉湯液體培養(yǎng)液接種于乳糖、葡萄糖、麥芽糖、菊糖、棉實糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇成品微量生化反應管，吲哚、明膠試驗，七葉苷，膽鹽溶解實驗，培養(yǎng)24~48h記錄各種生化管的反應情況。

1.2.3 分離細菌的16S rRNA分子生物學鑒定 （1）細菌總DNA的提取：使用熱裂解法快速提取細菌總DNA，取適當?shù)木鷳乙悍湃?.5ml無菌的離心管中，12000r/min離心1min，棄掉上清，將菌體重新懸于無菌水中，震蕩搖勻后，沸水浴7min，冰浴5min，離心，上清液作為基因擴增的模板。（2）16S rRNA的擴增和測序：設計寡核苷酸引物來擴增16S rRNA，使用引物如下：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’,R1-5’ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’。PCR反應體系50μl：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500mmol/L)5μl，2.5mmol/L dNTP 4μl，引物(20umol/L)各1μl，模板2μl，ddH2O36.8μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl。PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5μl用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物送交上海基因測序公司進行測序。（3）提交Genbank進行對比，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：采用Bioedit軟件參照正反序列圖譜對序列進行人工校對后，輸入Genbank用Blastn軟件進行相似性比較，并與Genbank中的相近序列和細菌模式菌株的16SrRNA序列用ClustalX1.83軟件進行多重序列匹配分析，然后利用Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用鏈接法獲取分支發(fā)育樹，系統(tǒng)發(fā)育樹各分支的置信度經(jīng)重抽樣1000次重復檢測，DNA序列變異中的轉(zhuǎn)換和顛換賦予相同的加權(quán)值。（4）判定細菌的系統(tǒng)發(fā)育地位：16SrRNA以相似性97%為界限，以高于97%判定為該菌。

1.2.4 病料PCR檢測 無菌取發(fā)病狐貍的肝、脾、腦，進行PCR檢測，設計引物，檢測有無腺病毒CAV。

1.2.5 分離細菌的藥敏試驗 接種環(huán)無菌取血清平板上的單個典型菌落，使用青霉素類、頭孢類、喹諾酮類等藥敏紙片法進行藥敏實驗，在血清平板上均勻涂抹，將標準化的藥敏片貼在涂布細菌的平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，使用直尺測量抑菌圈的直徑，觀察細菌對各種藥敏紙片的敏感程度，記錄結(jié)果。

1.2.6 分離細菌的毒力試驗 在無菌條件下使用接種環(huán)挑取典型的單個菌落，接種于加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫搖床震蕩培養(yǎng)24h，細菌培養(yǎng)液100倍稀釋后腹腔注射18~22g小白鼠，0.3ml/只共計5只，連對照組2只一起飼養(yǎng)，注射后觀察7日。細菌培養(yǎng)液100倍稀釋后腹腔注射1.5~2.0kg家兔，1ml/只，連對照組2只一起飼養(yǎng)，注射后觀察7日。細菌培養(yǎng)液100倍稀釋后腹腔注射70日齡狐貍，3ml/只，連對照組2只一起飼養(yǎng)，注射后觀察7日。記錄精神、飲食、糞便死亡情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

分離菌在血清平板上生長良好，為密集的細小的露珠樣透明菌落，兔鮮血瓊脂平板可見灰白色細小菌落呈現(xiàn)明顯的溶血環(huán)，麥康凱瓊脂、SS瓊脂不生長。在顯微鏡下觀察，可見細菌較純，染色呈現(xiàn)革蘭氏陽性球菌，細菌呈矛頭狀，多兩兩成對，很少單個存在，也有的連接成4個或者雙排。

2.2 細菌的生化結(jié)果

取0.2ml細菌馬丁肉湯液體培養(yǎng)液接種于成品微量生化反應管，可見細菌分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、菊糖、棉實糖、海藻糖，不分解山梨醇、甘露醇，吲哚、明膠試驗陰性，七葉苷陽性，膽鹽溶解陽性，對照鏈球菌主要病原菌生化特性，確診為肺炎鏈球菌。具體結(jié)果見表1。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

注：“—”表示陰性，“+”表示陽性

2.3 細菌的分子生物學鑒定結(jié)果

根據(jù)上海測序公司的測序結(jié)果，采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對序列進行人工校對，然后輸入Genbank用Blastn軟件進行相似性比較，最后利用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，與鏈球菌相似性為99.3%，最終確定為肺炎鏈球菌。

2.4 病料PCR檢測結(jié)果

無菌取發(fā)病狐貍的肝、脾、腦，進行PCR檢測，檢測無腺病毒CAV。

2.5 細菌的藥敏試驗結(jié)果

使用藥敏紙片法進行藥敏試驗，測量分離菌對各種藥物的敏感性，通過抑菌圈的大小指導用藥，檢測可見頭阿莫西林、青霉素、頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢噻呋鈉、左氧氟沙星、強力霉素高敏，恩諾沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素、安普霉素中度敏感，粘桿菌素、阿米卡星、林可霉素低度敏感，新霉素、紅霉素、阿奇霉素不敏感。具體藥敏結(jié)果見表2。

表2 分離菌的藥敏結(jié)果 (mm)

2.6 毒力試驗結(jié)果

100倍稀釋后的細菌培養(yǎng)液注射小白鼠第2天5只全部死亡，對照組觀察7日，全部健活，死亡小白鼠心血分離到革蘭氏陽性鏈球菌。100倍稀釋后的細菌培養(yǎng)液注射小白鼠第2天2只全部死亡，對照組觀察7日，全部健活，死亡家兔心血分離到革蘭氏陽性鏈球菌。分離的腦炎鏈球菌有較強的毒力。兩狐貍注射攻毒后第2天開始食欲減退，角弓反張，頭向后背，前肢向前、后肢向后，有時頭向一個方向彎曲轉(zhuǎn)動，第3天見死亡，對照組觀察7日正常。

3 討論

3.1 腦炎鏈球菌的分離鑒定

發(fā)病狐貍在分窩斷奶前一般50~70日齡，經(jīng)大量調(diào)差養(yǎng)殖場，很多養(yǎng)殖場此段時間都有發(fā)病，查閱以往2009年~2015年解剖記錄，每年5月~7月都有此種狐貍神經(jīng)癥狀來診斷的客戶，癥狀基本相同，角弓反張、癱瘓、食欲廢絕，分離后共同的診斷結(jié)果都為雙球菌。狐貍50日齡左右，正值狐貍從吃奶到吃料，自主活動的時間，各種器官發(fā)育不完全，容易受到外界環(huán)境的侵害，特別是一些環(huán)境致病菌，在機體發(fā)育不良的情況都容易發(fā)生。經(jīng)解剖實驗室培養(yǎng)，鏡檢可以確診為鏈球菌，又經(jīng)生化試驗進一步確診為肺炎雙球菌。

3.2 腦炎鏈球菌的癥狀

狐貍腦炎型肺炎雙球菌的主要癥狀是突然發(fā)病、食欲廢絕、角弓反張、癱瘓，很多養(yǎng)殖場以為是病毒性的腺病毒引起的，特別是未免疫的養(yǎng)殖場都認為零星死亡是正常的，也不做預防和治療，養(yǎng)殖場發(fā)病癥狀比較統(tǒng)一，大群精神食欲正常，一般1~2只前一天吃食完全正常，突然發(fā)病，神經(jīng)癥狀，最后呼吸急促，全身癱軟死亡，發(fā)病后治療一般無效，因為有細菌進入腦膜后很難治療。

3.3 腦炎鏈球菌的診斷

多種細菌病毒都可以感染狐貍引起腦炎癱瘓神經(jīng)癥狀，臨床上首先區(qū)分是否為傳染病，維生素B1缺乏也會引起癱瘓神經(jīng)癥狀死亡，喹諾酮類藥物使用過量也會引起癱瘓，缺鈣也會引起癱瘓，需要鑒別診斷。病理性的腺病毒也會引起狐貍腦炎，有別于細菌性的腦炎，腺病毒需要注射狐貍腦炎疫苗，藥物抗生素治療一般無效，細菌性的也有侵腦型的大腸桿菌，需要進行藥敏實驗，確定哪種藥物敏感才能進行治療，有效的控制疾病。若為維生素B1缺乏、缺鈣、喹諾酮類藥物使用過量、腺病毒腦炎使用抗生素將耽誤治療，越用藥越發(fā)病嚴重。此次病例發(fā)現(xiàn)后及時實驗室診斷，通過鏡檢發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陽性鏈球菌，腦膜細菌分離陽性，經(jīng)細菌分離、生化試驗、16S rRNA確診為肺炎鏈球菌。

3.4 腦炎鏈球菌的防治

腦炎鏈球菌現(xiàn)在沒有有效的疫苗進行防疫，只能從加強飼料管理、注意環(huán)境衛(wèi)生方面進行控制，不要飼喂變質(zhì)污染的飼料，發(fā)病的死亡狐貍及時消毒深埋處理，全場消毒，建議斷奶分窩狐貍胃腸較弱的時候都使用熟料，發(fā)病后及時診斷，及時采用敏感性高的藥物進行預防治療，有發(fā)病史的養(yǎng)殖場一般第二年還會發(fā)病，建議及時預防。本次病例，發(fā)病全群后每天使用聚維酮碘帶動物消毒，肉食飼料全部熟制，玉米膨化，診斷后第二天開始投服敏感藥物阿莫西林，出現(xiàn)發(fā)病的注射頭孢噻呋鈉，值45日齡左右的狐貍?cè)款^孢注射預防，第3天發(fā)現(xiàn)兩只，第4天發(fā)現(xiàn)一只，第5天開始未有新發(fā)病例，診斷后15d回訪，養(yǎng)殖場恢復正常，有效的控制了疫情。

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（2016–06–21）

S852.61+1

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1007-1733(2016)09-0014-03