雞霉形體的分離與藥敏試驗

王強 霍偉 任元剛

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雞霉形體的分離與藥敏試驗

王強 霍偉 任元剛

（山東省泰安市岱岳區(qū)山口鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 271038）（山東省泰安市岱岳區(qū)畜牧獸醫(yī)局） （濟南市商河縣現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園管理委員會）

選擇雞毒霉形體的敏感藥物，為臨床防治用藥提供理論依據(jù)。從雞場分別取疑似患霉形體病的雞進行血清學反應、病原分離培養(yǎng)和體外抑菌試驗。經(jīng)分離獲得雞毒霉形體12株，研究雞毒霉形體對甲磺酸左旋氧氟沙星、阿齊霉素等12種抗生素的抗藥性。結(jié)果表明，各種藥物對毒霉形體的敏感程度不同。

雞毒霉形體 培養(yǎng)基 平板凝集試驗 藥敏試驗 甲磺酸左旋氧氟沙星

雞霉形體病主要病原體為雞毒霉形體、滑液霉形體和依阿華霉形體。被感染的雞常表現(xiàn)為呼吸道癥狀，其特征為呼吸音異常、咳嗽、氣管炎、氣囊炎和流鼻液等。雞毒霉形體常引起較嚴重的呼吸道疾病，且病程長，發(fā)病率高。由于該病在集約化養(yǎng)雞場的普遍存在，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的威脅，因此如何有效地控制該病的發(fā)生已成為當前亟待解決的問題[1]。本試驗對雞毒霉形體進行分離培養(yǎng)和合理選用抗菌藥防治雞霉形體感染的研究對指導雞霉形體病的診斷和合理用藥有著重要的理論和實踐意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗病雞 疑似患霉形體感染的病雞取我區(qū)32各中、小型雞場，20~35日齡左右的商品肉雞，每場抽取2例，共計62只。

1.1.2 主要試劑 （1）培養(yǎng)基制備試劑：霉形體肉湯基礎培養(yǎng)基、豬血清、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶I)、鹽酸半胱氨酸、瓊脂粉、青霉素、制霉菌素、去離子水(自制）。（2）普通化學試劑：氫氧化鈉、鹽酸、酚紅。

1.1.3 雞霉形體標準抗原、陰性血清和陽性血清 雞毒霉形體平板凝集試驗抗原，雞陰性血清，MG-雞毒支原體陽性血清。

1.1.4 藥敏試驗 藥敏試紙片。

1.1.5 試驗儀器 UPWS-IV-120D超純水器、SW-WJ-LCU潔凈工作臺、PHS-3C精密PH計、FA2004N電子天平、電熱鼓風干燥箱、420型電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQG02型電熱式蒸汽消毒器、SA300PL普通光學顯微鏡、干燥器等。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備雞霉形體固體和液體培養(yǎng)基[2,3]按規(guī)程操作。

1.2.2 雞霉形體的分離培養(yǎng)及初步鑒定 （1）平板凝集試驗[8]：采集疑似患雞毒霉形體病的雞血液。在雞的翅靜脈采血約2ml左右放入離心管中，直立凝血后，經(jīng)1000r/min離心20min制得血清；取一塊干凈的玻板，劃出3cm×3cm的方塊，在每個方塊滴一滴雞毒霉形體平板凝集試驗抗原，然后在抗原邊滴一滴等量的待檢雞血清，用牙簽將抗原與被檢雞血清充分混勻。同時設雞毒霉形體陰性血清和雞毒霉形體陽性血清對照。混合物在室溫下2分中內(nèi)出現(xiàn)凝集塊者為陽性反應；無凝集塊者為陰性反應。（2）雞霉形體的分離培養(yǎng)：在超凈工作臺上剖檢雞毒霉形體平板凝集試驗陽性的病雞，用接種環(huán)鉤取病變的氣囊和支氣管內(nèi)容物接種于液體培養(yǎng)基中，同時直接接種于固體培養(yǎng)基，采用燭缸法進行培養(yǎng)。每天觀察液體培養(yǎng)基的變色情況，觀察培養(yǎng)液變色情況和渾濁度，有雜菌生長者棄去，無變化者每隔3d自傳1代。當培養(yǎng)物中酚紅變?yōu)殚冱S色時，將變色后的液體培養(yǎng)基再劃線接種到固體培養(yǎng)基平板上分離。接種完畢后，在皿底用記號筆作好序號和日期標記，平皿倒扣，放入干燥器中，點燃蠟燭，密封缸蓋，置于恒溫箱中37℃培養(yǎng)3~5d，觀察菌落生長情況。直接接種的固體培養(yǎng)基也要每天觀察菌落(顯微鏡4×10)，3d移植1次，病料至少培養(yǎng)觀察20d，有雜菌生長的棄去。（3）分離純化：將初步判定有霉形體生長的液體培養(yǎng)物劃線接種到固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)3~5d，挑取顯微鏡下觀察菌落呈“油煎蛋樣”的單個菌落再次移植到固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。即可獲得霉形體的純培養(yǎng)物。否則重復分離培養(yǎng)，直至獲得純培養(yǎng)物。（4）分離菌鑒定：取霉形體48h液體培養(yǎng)物以2000r/min離心30min，棄上清，用生理鹽水按100倍稀釋菌體，作為抗原原液。取兩滴自制抗原于載玻片上，一滴加雞毒霉形體陰性血清做對照，另滴加一滴雞毒霉形體陽性血清，充分混勻后判定結(jié)果，液滴中出現(xiàn)明顯的粗顆粒者為陽性。

1.3 藥敏試驗

本試驗采用藥物紙片瓊脂擴散法(紙片法)[5]。

1.3.1 菌液的配制 用接種環(huán)挑取純化的雞毒霉形體菌落1~2個，與5ml滅菌去離子水充分混合制成霉形體懸液。

1.3.2 菌液的涂布 取霉形體固體培養(yǎng)基平板，用滅菌的棉拭子蘸取菌液，在管壁上旋轉(zhuǎn)擠壓幾次，去掉過多的菌液。然后用拭子涂布整個培養(yǎng)基表面，反復幾次，每次平板旋60度，最后沿平皿四周繞兩圈，保證涂布均勻。

1.3.3 貼藥敏紙片 待平板上的水分被瓊脂完全吸收后開始貼藥敏紙片。用滅菌的眼科鑷子取供試藥敏紙片貼于瓊脂平板表面，用鑷尖輕壓，使其貼平。紙片一旦貼上就不能再移動，紙片間距大于24mm，紙片中心距平皿邊緣大于15mm。每貼完一張藥敏紙片后鑷子均在酒精燈上燒灼滅菌和破壞殘留的抗菌藥物。

1.3.4 培養(yǎng) 將貼有藥敏片的平皿放入燭缸中。37℃恒溫培養(yǎng)4~5d以上，觀察抑菌直徑。

1.3.5 結(jié)果判定標準 培養(yǎng)4~5d后取出平板，測量抑菌圈的直徑大小。抑菌圈的邊緣以肉眼看不到菌菌落明顯生長為限。按照抑菌圈直徑的大小判斷雞霉形體對藥物的敏感性(如表1)。

表1 藥物對霉形體抑菌效果的判定標準

2 試驗結(jié)果及分析

2.1 雞霉形體菌落形態(tài)

表2 雞毒霉形體的分離結(jié)果 (只、個）

從雞場采集的62只病雞中，經(jīng)分離獲得雞毒霉形體12株(如表2所示，同一患病雞群分離的按一株計)。有雞毒霉形體生長的培養(yǎng)基由紅色變成淡黃色，培養(yǎng)4~5d的菌落肉眼觀察白色呈露滴狀，生長極為緩慢。在光學顯微鏡下觀察，可見圓形“煎荷包蛋”樣菌落，光滑、邊緣整齊、具有一個顏色較深致密突起的中心，成乳頭狀，直徑在0.2~0.3mm之間。

2.2 雞霉形體藥物敏感性

對分離獲得的12株雞毒霉形體分別用鹽酸多西環(huán)素、硫酸慶大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、酒石酸泰樂菌素、阿齊霉素、硫氰酸紅霉素、磷酸替米考星、乳酸環(huán)丙沙星、甲磺酸左旋氧氟沙星、乳酸恩諾沙星、鹽酸林可霉素和氟苯尼考進行藥敏試驗。甲磺酸左旋氧氟沙星對10株雞毒霉形體的抑菌直徑多在21~25mm之間，其高敏率達83.3%，中度敏感率為16.7%，無一株耐藥；阿齊霉素對8株雞毒霉形體的抑菌直徑在12~18mm，即雞毒霉形體對其中度敏感，敏感率為66.7%，耐藥率為33.3%。乳酸恩諾沙星對9株雞毒霉形體的抑菌直徑在12~17mm，即雞毒霉形體對其中度敏感，敏感率為75%，耐藥率為25%。鹽酸林可霉素、硫氰酸紅霉素、酒石酸泰樂菌素、磷酸替米考星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸慶大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸環(huán)丙沙星和氟苯尼考對12株雞毒霉形體的抑菌直徑多在0~12mm之間，即雞毒霉形體對鹽酸林可霉素、硫氰酸紅霉素、酒石酸泰樂菌素、磷酸替米考星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸慶大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸環(huán)丙沙星和氟苯尼考耐藥。其抑菌結(jié)果見表3。

表3 雞毒霉形體對藥物的敏感情況 (%)

3 結(jié)論

（1）本試驗采用青霉素和制霉菌素代替醋酸鉈的雞霉形體肉湯培養(yǎng)基成功分離培養(yǎng)出了雞毒霉形體。（2）從雞毒霉形體藥物敏感性試驗測定的結(jié)果看，岱岳區(qū)分離的12株雞毒霉形體，對甲磺酸左旋氧氟沙星高度敏感，且高敏率達83.3%；對阿齊霉素和乳酸恩諾沙星中度敏感，敏感率分別為66.7%和75%；對鹽酸林可霉素、硫氰酸紅霉素、酒石酸泰樂菌素、磷酸替米考星、鹽酸多西環(huán)素、硫酸慶大霉素、硫酸丁胺卡那霉素、乳酸環(huán)丙沙星和氟苯尼考耐藥。

[1] 丁銀巧, 烏尼, 郝永清等. 內(nèi)蒙古地區(qū)雞源霉形體的分離和鑒定[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)牧學院學報, 1998(1): 36-41.

[2] 姚火春. 獸醫(yī)微生物試驗指導(第2版) [M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 19-21.

[3] 郭銳. 雞毒霉形體的分離鑒定及其16S/23SrRNA基因間隔區(qū)、TM-1基因序列差異分析[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學, 2006: 35-42.

[4] 李凱倫, 崔玉蒼. 豬雞疫病免疫診斷技術(shù)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)大學出版社, 2004: 485-486.

[5] 馬興樹. 禽傳染病實驗診斷技術(shù)[M]. 北京: 化學工業(yè)出版社, 2006: 105-122.

（2016–04–25）

S852.62

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