黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞成熟能力的影響

孫志永 姚海飛 陳奇 袁永莉

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黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞成熟能力的影響

孫志永①姚海飛②陳奇③袁永莉②

（①江蘇省洪澤縣動物衛生監督所 223100 ②江蘇省洪澤縣動物疫病預防控制中心 ③江蘇省清浦區動物衛生監督所）

黃曲霉素B1是威脅家禽養殖業的主要毒素之一，然而對禽免疫細胞-樹突狀細胞的免疫功能調控尚不明確。本試驗通過B1作用體外誘導培養的雞樹突狀細胞，測定其表型標志CD40和CD86的表達情況。結果發現，B1作用樹突狀細胞24h后，顯著上調了CD40和CD86的表達(P<0.05)，卻顯著下調MHCII的表達(P<0.05)。表明B1促進雞樹突狀細胞不完全的功能成熟。

黃曲霉素 雞樹突狀細胞 表型

禽飼料中的黃曲菌能夠產生大量的黃曲霉素。黃曲霉素B1是其主要形式。在家禽中，B1可以引起家禽胃腸道前段的腺胃和肌胃發生炎癥、肝毒性、血液毒性等。此外，B1對免疫系統也具有抑制作用，是導致家禽疫苗免疫接種頻頻失敗的重要原因[1]。

樹突狀細胞(Dendritic cells，DCs)是激活宿主早期天然免疫和后期獲得性免疫的重要抗原提呈細胞[2]。在家禽中，DCs的免疫功能，特別是功能成熟方面，是保證各種疫苗免疫效力的關鍵。因此本研究旨在闡明黃曲霉素B1對雞DCs成熟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

黃曲霉素B1從A. flavus NRRL 5518菌株純化(美國國家利用研究中心)。完全細胞培養液：細胞培養基(RPMI1640，life)、抗生素(青鏈霉素，南京生興)、10%胎牛血清(Gbico)、重組雞GM-CSF(Abcam)和IL-4(Kingfisher)各50ng/ml。抗體：抗雞FITC-MHCII(Abcam)、鼠抗雞CD40和CD86(AbD serotec)、PE標記羊抗鼠二抗(Mul-tiscience)2周SPF雞購自江南家禽育種有限公司。

1.2 方法

1.2.1 雞骨髓DCs的培養 依照文獻進行適當改進[3]，首先無菌剝離2周SPF雞的股骨和脛骨，將骨髓用RPMI1640培養基沖出，離心收集細胞，應用密度梯度離心法(Histopaque-1119,1.119g/ml, 25℃;Sigma)純化目的細胞。隨后，應用完全培養液重懸細胞并鋪板，放置37℃，5% CO2培養箱。每隔兩天(第2天和第4天)半量換液，第7天收集懸浮細胞并進行形態學觀察鑒定。

1.2.2 雞DCs表型測定 黃曲霉素B1(10ng/ml)與DCs作用24h后，收集細胞，分別應用FITC-MHCII直接免疫熒光染色、CD40和CD86間接免疫熒光染色，最后洗滌細胞3次后，轉入流式專用管，應用流式細胞儀進行上機檢測。

2 結果與分析

2.1 雞DCs形態學鑒定

骨髓前體細胞經過7天的細胞因子誘導培養，逐漸由體型較小圓形細胞分化為較大的并具有典型樹突樣結構的細胞(圖1)，以上為雞DCs的典型形態學特征。

圖1 雞DCs形態學特性鑒定（注：DCs樹突(箭頭)）

2.2 雞DCs表型變化

由圖2所示，黃曲霉素B1刺激DCs 24 h后，與對照組(Mediun)相比，CD40和CD86的表達顯著上調(P<0.05)，而MHCII的表達顯著下調(P<0.05)，表明黃曲霉素B1促進DCs不完全成熟。

圖2 雞DCs表型標志變化（注：*表示組間差異顯著(P<0.05)）

3 討論

家禽從飼料中攝入的黃曲霉素B1水平一般處于較低濃度，并不致死。但嚴重影響家禽的生產性能和免疫接種效力。當疫苗接種后，DCs作為重要的抗原遞呈細胞，攝取抗原并快速功能成熟和活化，并向附近引流淋巴結遷移，向淋巴細胞遞呈抗原，最終啟動獲得性免疫應答[2]。因此，DCs功能成熟程度是關鍵。在成功誘導培養具有典型特征雞DCs的基礎上，評價了B1對DCs功能成熟的影響。結果表明DCs僅能上調CD40和CD86，而不能上調MHCII分子。MHCII是DCs將抗原遞呈給T細胞的第一信號，CD40和CD86是第二接頭信號，根據免疫學原理，只有雙信號均能有效啟動，DCs才能完成抗原的遞呈[4]。因此本研究結果最終表明B1受損了DCs的抗原遞呈功能。張鑫雷等[5]發現B1受損雞DCs對T細胞增殖能力也驗證了以上結論。

[1] 馮建蕾. 黃曲霉毒素的危害和防治[J]. 中國畜牧獸醫. 2005(12).

[2] Chang SY, Ko HJ, Kweon MN. Mucosal dendritic cells shape mucosal immunity. Experimental & molecular medicine. 2014;46:e84.

[3] 李冉, 王桂軍, 王漢清等. 雞骨髓源樹突狀細胞的誘導分化及鑒定[J]. 中國預防獸醫學報. 2011(09).

[4] 馮鐘煦, 劉劍勇. 樹突狀細胞的研究進展[J]. 醫學綜述. 2012(20).

[5] 張鑫雷, 應志豪.。黃曲霉素B1對雞骨髓源樹突狀細胞抗原遞呈能力的影響[J]. 現代農業科技. 2015(3).

（2016–06–23）

S852.69

A

1007-1733(2016)09-0024-02