危害鳳尾菇生產的一種小包腳菇屬草菇屬物種的形態和分子鑒定*

張其坤，何曉蘭，彭衛紅**，陳　影，黃忠乾

（1．樂山市農業科學研究院，四川 樂山 614000；2．四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3．農業部西南區域農業微生物資源利用科學觀測實驗站，四川 成都 610066）

危害鳳尾菇生產的一種小包腳菇屬草菇屬物種的形態和分子鑒定*

張其坤1，何曉蘭2，3，彭衛紅2，3**，陳影2，3，黃忠乾2，3

（1．樂山市農業科學研究院，四川 樂山 614000；2．四川省農業科學院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3．農業部西南區域農業微生物資源利用科學觀測實驗站，四川 成都 610066）

近年來，在四川樂山地區鳳尾菇（Pleurotus pulmonarius）栽培中，首次發現1種形態與草菇類似的大型真菌類污染菌。該菌在栽培場中的污染率可達60%以上，對鳳尾菇的生產造成較大威脅。經初步鑒定為小包腳菇屬（Volvariella）的木生小包腳菇 [Volvariella diplasia(Berk．&Broome)Singer]。該菌子實體形態與草菇類似，菌絲耐低溫，可在4℃冰箱中保藏；原基形成和子實體發育溫度范圍廣（13℃～33℃）；子實體叢生或單生，單粒種可達20 g以上，具有一定的開發價值。

鳳尾菇；小包腳菇屬；草菇；雜菌

2012年10月，我們在峨眉山市符溪鎮黑橋村的栽培鳳尾菇 [Pleurotus pulmonarius(Fr．)Quél．]的菇棚中發現1種影響鳳尾菇生產，并可形成大型子實體的污染菌。因其子實體老熟后會發黑腐爛，菇農稱其為“牛屎菌”，但與俗稱的“牛屎菌”鬼傘明顯不同。進一步的調查發現，該菌對樂山市鳳尾菇生產有較大的威脅，危害嚴重地區污染率可達60%以上。2014年在四川沐川縣、蘇稽鎮等地相繼發現該菌的危害，并有蔓延的趨勢。受到侵染后的鳳尾菇菌袋產量顯著下降，栽培效益明顯降低。同時，該菌子實體形態與草菇類似，但形成子實體的溫度范圍較草菇廣泛，似乎又具有一定的開發價值，為確定該雜菌的類型，發掘評價該類大型真菌的利用潛力，并為鳳尾菇栽培防控該類雜菌的侵染奠定基礎，本課題組對該菌進行了分離鑒定工作，現將結果報道如下。

1　材料和方法

1.1材料來源

樣品采自峨眉山市符溪鎮黑橋村，分離及形態觀察的菌種采用PDA培養基培養。

1.2形態特征鑒定方法

對該雜菌新鮮子實體進行了拍照和宏觀形態特征記錄，并對分離菌種進行純培養，子實體烘干后對其進行顯微特征觀察和描述。

1.3分子系統發育分析

采用基因組DNA提取方法，以子實體為材料，利用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。

1.3.1ITS序列分析

采用真菌通用引物ITS4（5’-TCCTCCGCTTATT GATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTA ACAAGG-3’）。反應體系為30 μL，該體系包括2× PCR Master Mix 15 μL，Primer（1 μmol·L-1） 各1μL；模板DNA 1 μL，ddH2O 12 μL。PCR擴增程序：94℃預變性3 min；94℃變性1 min，54℃退火l min，72℃延伸2 min，共計35個循環；循環結束后72℃延伸8 min。PCR擴增產物經克隆后送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.3.2分子系統發育分析

運用Clustal[2]軟件比對從GenBank下載小包腳菇屬（Volvariella） ITS序列及本研究所得序列。以Pluteusromellii(Britzelm.)Sacc.和Pluteusatromarginatus(Konrad)Kühner作為外群，基于最大簡約法，利用Paup軟件構建小包腳菇屬的系統發育關系[3]。

2　結果與分析

2.1病害的主要癥狀

該病害在鳳尾菇菌袋滿袋后的各個時期都可發生。在鳳尾菇出菇前受到侵染時，菌袋菌絲生長纖細，濃白，滿袋后15 d左右開始轉淡；受害的菌袋較正常菌袋松軟；該雜菌常在受害菌袋表面或袋口形成原基并逐漸發育形成子實體，并造成鳳尾菇幼菇死亡；該菌在菇棚內形成子實體發生的溫度范圍廣，13℃～33℃均可見子實體在菌袋上形成（圖1）。當前僅見危害鳳尾菇菌袋，未見危害鄰近菇棚的平菇栽培袋。受到侵染后，鳳尾菇原基形成受到影響，子實體生長緩慢，產量明顯降低。在栽培大棚內污染率較高，可達60%以上。

圖1　鳳尾菇菌袋被危害癥狀及雜菌不同階段子實體形態Fig.1　Symptoms of disease in Pleurotus pulmonarius cultivation and morphology of Volvariella diplasia fruiting body in diffferent phase

2.2形態及生物學特征

2.2.1學名

木生小包腳菇，Volvariella diplasia(Berk.& Broome)Singer,Lilloa 22:401(1951)，圖2。

Agaricus diplasius Berk.&Broome,Trans.Linn. Soc.27:151(1870).

Volvaria diplasia(Berk.&Broome)Sacc.,Syll. fung.(Abellini)5:658(1887).

2.2.2特征

子實體叢生或單生；菇體顏色灰白至淺黃色，上有灰黑色斑（顏色深淺受光照強度與噴水影響）；蕾期緊實，菌肉白色，之后包膜頂端逐漸變薄，菌褶變為淡黃色，菌蓋上出現披針狀絨毛，顏色轉為鵝毛黃；破膜后，包膜變為菌托，無菌環，傘狀，菌柄中生；菌蓋上有濃密的鵝毛黃披針狀絨毛，長2mm～4 mm，菌肉白色，菌褶粉紅色，菌柄實心，展開后菌蓋直徑可達16 cm；孢子印粉紅色（圖2b），菌褶延生（圖2b）。

子實體出菇溫度廣，18℃～33℃均能出菇，調查發現可耐受13℃的低溫，形成正常子實體；組織分離的菌絲在PDA培養基上生長正常，可在4℃左右冰箱中保藏，在1/2PDA培養基上菌絲稀疏（圖2c），可形成子實體。

孢子 [（6.5） 7.0～8.5（9.5）]μm×（4.5～6.0）μm，光滑，橢圓形，淺褐色（圖2a）。擔子棒狀，具4個擔子小梗。褶緣囊狀體寬棒狀，無色透明，壁較薄。側生囊狀體較多，同褶緣囊狀體。

圖2　木生小包腳菇的孢子（a）、孢子印（b）及菌落形態（c）Fig.2　Morphological characteristics of spores（a）,spore print（b）and colony of Volvariella diplasia（c）

Volvariella diplasia是報道自斯里蘭卡的1個木生的小包腳菇屬種類，與銀絲草菇V.bombycina (Schaeff.)P.Kumm.極為相似。

2.3分子系統發育分析

ITS序列已提交至GenBank保存。基于最大簡約法，小包腳菇屬系統發育樹見圖3。

圖3　基于最大簡約法小包腳菇屬系統發育樹Fig.3　Phylogenetic tree of Volvariella based on maximum parsimony method

ITS測序結果經blast比對，該菌與GenBank中來 自 歐 洲 鑒 定 為 V.bombycina（HM562212，EU920673.1） 的序列相似性為97%～98%，存在10個～16個堿基的差異；與GenBank中其他小包腳菇屬相似性較低，這與形態學鑒定結果相吻合，確定該菌為木生小包腳菇（V.diplasia）。

分子系統發育分析結果顯示，V.diplasia、V. bombycina和V.volvacea這三個種親緣關系較近，聚于同一個分支，且支持率達100%。

3　討論

Singer[5]曾注意到草菇V.volvacea的有些栽培品種通常是白色，許多研究者就將其作鑒定為木生小包腳菇V.diplasia；有文獻也報道木生小包腳菇V. diplasia是印度1個重要的栽培種類，但這些文獻中均記載其是草腐菌[6]，這與真正的木生小包腳菇V. diplasia木生的特點并不相符，可能印度記載的栽培木生小包腳菇 V.diplasia實質上也是草菇 V. volvacea。

對于該雜菌的來源，我們認為盡管各菌種廠家均沒有生產與該菌類似的菌種，也不能排除因各種不明原因造成污染的可能性。鳳尾菇栽培中出現的該雜菌感染可能來自鳳尾菇菌種，由于在菌種生長階段的檢查不嚴，可能造成菌種帶菌并污染。

2014年已相繼在樂山市的沐川縣幸福鄉柏香村、市中區蘇稽鎮饒坎村等地發現同樣的雜菌危害，并出現蔓延的趨勢。主要危害鳳尾菇菌袋，而對鄰近的中高溫型的平菇不造成危害。通過調查還發現，發生該菌為害的場地，菌袋配方均以木屑等為主料，似乎表明該菌趨向為1種木腐菌，而不是草腐菌，這也與V.diplasia木生的特點相符。

雖然目前木生小包腳菇V.diplasia對鳳尾菇生產造成嚴重減產，但另一方面由于小包腳菇屬有許多可食用的種類，初步的實驗也證明木生小包腳菇V.diplasia無毒，可食用，且該菌與我國南方規模化栽培的草菇（V.volvacea）有明顯差異，尤其是其對溫度的敏感性不強，子實體形成溫度范圍廣，適宜四川省夏季栽培，具有進一步開發利用價值。

[1]White TJ,Bruns T,Lee SS,et al．Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]//Innis MA,Gelfand DH,Sninsky JJ,White TJ(eds), PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications．New York:Academic Press,1990:315－322．

[2]Thompson JD,Gibson TJ,Plewniak F,et al．The CLUSTAL X windows interface:flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J]．Nucleic Acids Research,1997,25(24):4876－4882．

[3]Swofford DL．PAUP*:phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods)version 4．0b10[M]．Sunderland:Sinauer,2003．．

[4]Pegler DN．Agaric flora of Sri Lanka[M]．London:Kew Bulletin Additional Series,1986:519．

[5]Singer R．Mushrooms&truffles[M]．London:Leonard Hill, 1961a:272．

[6]Ahlawat OP,Kumar S,Arumuganathan T,et al．25 years of AICRP(mushroom)[M]．New Delhi:Yugantar Prakashan Pvt．Ltd．,2008．

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Identification of a Volvariella Species Which Hazard Pleurotus pulmonarius Cultivation

ZHANG Qi-kun1,HE Xiao-lan2,3,PENG Wei-hong2,3,CHEN Ying2,3,HUANG Zhong-qian2,3
(1．Leshan Academy of Agricultural Science,Leshan 610066,China;2．Soil and Fertilizer Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;3．Scientific Observing and Experimental Station of Agro－microbial Resource and Utilization in Southwest China,Ministry of Agriculture,Chengdu 610066,China)

In recent years,a species of Volvariella was found in the cultivation of Pleurotus pulmonarius,which infected P.pulmonarius up to 60%and caused seriously damage．It was identified as V.diplasia based on the morphology and molecular evidence．Volvariella diplasia resembles V.volvacea in morphology,while the mycelium of V.diplasia had low－temperature resistance character and could be deposited at 4℃．Its primordia formation and fruiting temperatures range was 13℃to 33℃,the basidiomata was gregarious or solitary,and one fruitbody weight was up to 20 g．V.diplasia could be a candidate for exploiting as edible mushroom．

Pleurotus pulmonarius;Volvariella spp．;Volvariella volvacea;mushroom disease

S646.9

A

1003-8310（2016）0106-0051-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．012

四川食用菌創新團隊資金資助項目（川農業函 [2014]91號）；四川省微生物資源共享平臺建設（15010302）；西南地區作物秸稈基質化利用技術（201503137）。

張其坤（1967－），男，本科，高級農藝師，主要從事食用菌栽培技術研究。E－mail:qi0102kun＠163．com

**通信作者：彭衛紅（1970－），女，碩士，研究員，主要從事食用菌遺傳育種與病害防控研究。E－mail:pwh424＠163．com

2016－09－16