靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用*

金凌云，黃樣增，吳長(zhǎng)輝，李 曄**，陳冠敏

（1．福建仙芝樓生物科技有限公司，藥用菌栽培與深加工國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350002；2．福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001）

〈生理生化〉

靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用*

金凌云1，黃樣增1，吳長(zhǎng)輝1，李 曄1**，陳冠敏2

（1．福建仙芝樓生物科技有限公司，藥用菌栽培與深加工國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350002；2．福建省疾病預(yù)防控制中心，福建 福州 350001）

探討靈芝（Ganoderma lucidum）孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用。分別設(shè)定0．167 g·kg－1、0．333 g·kg－1、1．00 g·kg－1三個(gè)劑量組，以及乙醇模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。各劑量組經(jīng)口灌胃給予受試物，溶劑對(duì)照組和乙醇模型組給予食用植物油。30 d后，用乙醇建立急性酒精性肝損傷小鼠模型。16 h后處死動(dòng)物，測(cè)定肝組織中甘油三酯（TG）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA），同時(shí)取肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果表明樣品可以降低3個(gè)劑量組小鼠急性酒精性肝損傷后第16小時(shí)肝組織中TG含量和中劑量組MDA含量，肝臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，乙醇模型對(duì)照組動(dòng)物肝損傷程度高于溶劑對(duì)照組（P＜0．05）。結(jié)論證明靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)急性酒精肝損傷具有輔助保護(hù)功能。

靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑；酒精性肝損傷；乙醇模型；ICR小鼠

我國(guó)是飲酒大國(guó)，因長(zhǎng)期大量飲酒導(dǎo)致的酒精性肝病（alcoholic liver diseases，ALD） 發(fā)病率在我國(guó)有逐年上升的趨勢(shì)，已成為繼病毒性肝炎后導(dǎo)致肝損害的第二大病因。ALD的發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，可能與酒精的毒性作用、氧化應(yīng)激等因素有關(guān)，西醫(yī)對(duì)肝損傷的藥物治療療法并不十分肯定，臨床用藥如糖皮質(zhì)激素、己酮可可堿、英夫利昔等，僅能改善患者生存率或生存期，且容易出現(xiàn)副作用，治療效果并不明顯[1－2]。近年來中醫(yī)在肝損傷治療方面的研究有了長(zhǎng)足發(fā)展，充分發(fā)揮中醫(yī)藥在肝病治療方面的優(yōu)勢(shì)，日漸成為研究熱點(diǎn)[3]。

靈芝（Ganoderma lucidum） 是擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）多孔菌科（Polyporaceae） 赤芝或紫芝的干燥子實(shí)體，是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，已被廣泛地用作治療各種病因引起的肝炎[4]。靈芝中多糖和三萜類化合物被認(rèn)為是對(duì)化學(xué)毒物所致肝損傷有保護(hù)作用的活性成分。靈芝多糖能抗酒精性肝損傷和病毒性肝炎[5]，靈芝三萜類化合物對(duì)CCl4等損傷模型鼠也顯示出有效的保護(hù)作用[6]。靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑是以靈芝孢子油、靈芝（赤芝、紫芝）提取物制成，集合了靈芝的多種功效成分。本文主要對(duì)靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑在小鼠酒精性肝損傷保護(hù)方面的作用進(jìn)行研究，進(jìn)而對(duì)靈芝復(fù)合制劑的功能性提供理論支持。

1　材料

1.1動(dòng)物

清潔級(jí)ICR小鼠，雌性，18 g～22 g，共50只，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2012－0002。

1.2藥物及試劑

受試物靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑，由仙芝科技（福建）股份有限公司提供。生化試劑盒購(gòu)自南京建成生化試劑有限公司，分析純乙醇購(gòu)自上海化學(xué)試劑一廠，用蒸餾水配制成濃度為50%的乙醇溶液。

1.3儀器

日立7060C全自動(dòng)生化分析儀、生物U1800紫外可見分光光度計(jì)、電子天平、Leica CM－1950冰凍切片機(jī)、OlympusBX51T－32E顯微鏡。

2　方法

2.1分組、給藥及造模

將小鼠隨機(jī)分成5組，每組10只，即低、中、高劑量組（受試物濃度分別為0．167 g·kg－1、0．333 g·kg－1、1．00 g·kg－1），空白對(duì)照組、模型對(duì)照組。每日稱取受試物樣品10．0 g，加食用植物油定容至100 mL，搖勻，作為高劑量組受試物；取高劑量組受試物50 mL，加食用植物油定容至150 mL，搖勻，作為中劑量組受試物；取中劑量組受試物50 mL，加食用植物油定容至100 mL，搖勻，作為低劑量組受試物。模型對(duì)照組乙醇濃度為50%（V·V－1）。

3個(gè)劑量組動(dòng)物每日經(jīng)口灌胃給予受試物，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等量食用植物油，灌胃劑量為10 mL·kg－1，連續(xù)30 d。動(dòng)物每周稱重2次，以調(diào)整受試動(dòng)物灌胃量，自由飲食、飲水。

2.2動(dòng)物造模

實(shí)驗(yàn)第30天將各組動(dòng)物稱重，模型組及各劑量組動(dòng)物按照0．012 mL·g－1一次性灌胃給予50%（V·V－1）乙醇染毒，空白對(duì)照組給予蒸餾水。

2.3指標(biāo)測(cè)定

禁食16 h后，處死動(dòng)物觀察肝組織外觀性狀，并取部分肝組織，勻漿，測(cè)定肝組織中TG、GSH、MDA含量，同時(shí)取肝臟進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.4試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。空白對(duì)照組和乙醇模型對(duì)照組比較用t檢驗(yàn)；各樣品組與乙醇模型對(duì)照組比較用單因素方差分析。經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，方差齊的試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)方差不齊或非正態(tài)的試驗(yàn)數(shù)據(jù)先進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

3　結(jié)果

3.1靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)小鼠體重的影響

靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)小鼠體重的影響，結(jié)果見表1。

受試物各組小鼠的初始體重經(jīng)方差分析檢驗(yàn)，差異不顯著（P＞0．05），即小鼠的初始體重在各組間較為均衡；經(jīng)口灌胃30 d后，各組小鼠的體重增長(zhǎng)值經(jīng)方差分析檢驗(yàn)，差異不顯著（P＞0．05），即受試物對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)無影響。

3.2靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)肝組織中TG、GSH、MDA含量的影響

靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)肝組織中TG、GSH、MDA含量的影響，結(jié)果見表2。

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型對(duì)照組小鼠肝組織中的TG、MDA含量均高于空白對(duì)照組，GSH含量低于空白對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，差異顯著（P＜0．05），說明動(dòng)物模型建模較成功。受試物3個(gè)劑量組肝組織TG含量、中劑量組MDA含量低于模型對(duì)照組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，差異顯著（P＜0．05），說明靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑可顯著降低酒精性肝損傷小鼠肝組織中TG、MDA含量水平。

表1　各組小鼠的初始體重、結(jié)束體重、增重（±S）Tab．1　Initial body weight,final weight and weight gain of mice in each group（±S）

表1　各組小鼠的初始體重、結(jié)束體重、增重（±S）Tab．1　Initial body weight,final weight and weight gain of mice in each group（±S）

組別　動(dòng)物數(shù)/只　初始體重/g　P　結(jié)束體重/g　P　增重/g　P空白對(duì)照組　10　19．9±1．4　1．000　38．3±1．9　1．000　18．4±2．6　1．000模型對(duì)照組　10　19．9±1．4　－　38．3±2．4　－　18．4±2．3　－低劑量組　10　19．8±1．5　0．875　38．7±1．9　0．683　18．9±2．0　0．668中劑量組　10　19．7±1．3　0．753　40．0±2．2　0．087　20．3±3．0　0．108高劑量組　10　19．7±1．3　0．753　39．4±2．4　0．264　19．7±2．9　0．268

表2　靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝組織TG、GSH、MDA含量的影響（±S）Tab．2 Effects of Ganoderma lucidum spore oil and extract complex preparation on the content of TG,GSH,MDA in mice liver tissue（±S）

表2　靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑對(duì)小鼠肝組織TG、GSH、MDA含量的影響（±S）Tab．2 Effects of Ganoderma lucidum spore oil and extract complex preparation on the content of TG,GSH,MDA in mice liver tissue（±S）

注：*與模型對(duì)照組比較，P＜0．05；＃與空白對(duì)照組比較，P＜0．05。Note:*Compared with the model control group,P＜0．05;＃Compared with the control group,P＜0．05．

組別　動(dòng)物數(shù)/只　TG/(mmol·kg－1)　P　GSH/(mg/g·prot－1)　P　MDA/(nmol/mg·prot－1)　P空白對(duì)照組　10　113．0±19．30　0．002　3．30±0．72　0．002　1．64±0．23　0．001模型對(duì)照組　10　153．0±29．50＃　－　2．30±0．50＃　－　2．65±0．64＃　－低劑量組　10　114．8±13．90*　0．016　2．54±0．55　0．345　2．29±0．52　0．156中劑量組　10　112．8±21．68*　0．018　2．56±0．58　0．304　2．08±0．50*　0．025高劑量組　10　120．6±13．70*　0．046　2．57±0．60　0．292　2．47±0．49　0．468

3.3肝臟組織病理學(xué)檢查結(jié)果

3．3．1肉眼觀察

空白對(duì)照組：肝臟表面平整光滑，色澤亮呈鮮紅色，質(zhì)軟。

模型對(duì)照組：肝臟表面有顆粒狀，色澤變淡呈土黃色，質(zhì)稍硬。

各劑量組：肝臟表面有均勻細(xì)顆粒，色澤呈略黃、深褐色或土黃色，質(zhì)軟或稍硬。

3．3．2鏡檢

小鼠肝臟病組織學(xué)檢查結(jié)果見表3。

表3　小鼠肝臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果（±S）Tab．3　Histopathological examination of mice liver tissue（±S）

表3　小鼠肝臟病理組織學(xué)檢查結(jié)果（±S）Tab．3　Histopathological examination of mice liver tissue（±S）

注：*與模型對(duì)照組比較，P＜0．05；＃與空白對(duì)照組比較，P＜0．05。Note:*Compared with the model control group,P＜0．05;＃Compared with the control group,P＜0．05．

組別　動(dòng)物數(shù)/只　脂滴面積積分　P空白對(duì)照組　10　0．4±0．7　0模型對(duì)照組　10　3．2±0．8＃　－低劑量組　10　2．0±0．7*　0．001中劑量組　10　1．8±0．8*　0高劑量組　10　2．5±0．8　0．051

由表3可見，模型組動(dòng)物脂滴在肝臟的分布、范圍和面積積分均高于空白對(duì)照組；低、中劑量組動(dòng)物的脂滴在肝臟的分布、范圍和面積積分均低于模型對(duì)照組，且差異顯著（P＜0．05）。

4　討論

肝損傷是指在一系列理化因素作用下，肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡，是各種肝病發(fā)生發(fā)展的最基本病理狀態(tài)[7]。酒精是導(dǎo)致肝損傷的一個(gè)重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體大量攝入乙醇后，在乙醇脫氫酶作用下大量脫氫氧化，影響三羧酸循環(huán)，并減弱脂肪酸氧化，從而影響脂肪代謝；乙醇可致α－磷酸甘油增多而促進(jìn)TG合成，致使脂肪在肝細(xì)胞內(nèi)沉積，同時(shí)乙醇能激活氧分子，產(chǎn)生的氧自由基可導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生MDA及體內(nèi)還原型GSH的耗竭。因而TG、GSH和MDA含量常可反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，間接反映體內(nèi)組織、細(xì)胞損傷程度[5，8]。

靈芝是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益中藥，被歷代醫(yī)家視為滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本、延年益壽之珍品。現(xiàn)代藥理與臨床研究證實(shí)，靈芝具有多方面生理活性和藥理作用，尤其在保肝護(hù)肝方面具有較好的功效[9－11]。目前研究多認(rèn)為其保肝功效與其清除自由基、抗氧化等作用有關(guān)。陳瓊瑤[12]等的研究表明靈芝孢子粉對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)作用。何慧[4]等研究表明靈芝肽對(duì)酒精性肝損傷具有保護(hù)功能，其良好的保肝效果可能與其優(yōu)異的抗氧化能力有關(guān)。周昌艷[5]等研究表明靈芝多糖可以提高模型小鼠的GSH、GSH-Px和SOD水平，同時(shí)降低MDA、TG水平，具有一定的預(yù)防酒精性肝損傷作用。樸日龍[13]等、李曄[14]等、黃建康[15]等的研究均表明靈芝孢子油對(duì)CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷也具有輔助保護(hù)作用。

本文所用材料靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑中含有全靈芝的多種功效成分，其中以靈芝多糖和三萜類為主要活性物質(zhì)，本研究結(jié)果得出樣品可以降低3個(gè)劑量組小鼠急性酒精肝損傷后第16小時(shí)肝組織中的TG含量和中劑量組MDA含量，且低、中劑量組小鼠的脂滴在肝臟的分布、范圍和面積積分低于乙醇模型對(duì)照組。結(jié)論表明靈芝孢子油提取物復(fù)合制劑在有效地降低了酒精代謝過程中TG、MDA的產(chǎn)生，并減少了受損肝臟中脂肪的沉積，對(duì)酒精性肝損傷具有輔助保護(hù)的功能。靈芝的保肝作用已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛證實(shí)，且與其較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基功能有關(guān)，但其抗氧化、抗自由基的具體作用環(huán)節(jié)仍有待進(jìn)一步研究。

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Effects of Ganoderma lucidum Spore Oil and Extract Complex Preparation on Mice with Alcoholic Liver Injury

JIN Ling-yun1,HUANG Yang-zeng1,WU Chang-hui1,LI Ye1,CHEN Guan-min2
(1．Fujian Xianzhilou Biological Science and Technology Co．Ltd．,Research Center of Medicinal Mushroom Cultivation and Deep Processing of Local and National United Engineering,Fuzhou 350002,China;2．Fujian Center of Disease Control and Prevention,Fuzhou,Fujian 350001,China)

Effects of Ganoderma lucidum spore oil and extract complex preparation on mice with alcoholic liver injury were studied in this paper．The experiment was employed with 5 treatments,such as 0．167 g·kg－1,0．333 g·kg－1,1．00 g·kg－1dosage group,blank control and ethanol model control group．Three dosages of samples were given orally with blank control and ethanol model control groups given edible vegetable oil．30 days later,the mouse model of acute alcoholic liver injury was established by ethanol．The animals were sacrificed after 16 hours,and the livers were collected for the triglycercide(TG),glutathione(GSH),methane dicarboxylic aldehyde(MDA)measurements and liver histopathological examination．The results showed that three dosages of samples significantly reduced the TG content in mice liver tissue at the 16th hour after the alcoholic treatments while the middle dosage sample reduced the MDA content．And the ethanol model control group showed higher damage degree than the blank control group(P＜0．05)．It was concluded that G.lucidum spore oil and extract complex preparation exhibited a protective effect on acute alcohol liver injury．

Ganoderma lucidum spore oil and extract complex preparation;alcoholic liver injury;ethanol model;ICR mice

S646.9

A

1003-8310（2016）06-0034-04

10．13629/j．cnki．53－1054．2016．06．008

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)的部分研究?jī)?nèi)容（201303080）。

金凌云（1985－），女，碩士，工程師，主要從事珍稀食（藥）用真菌的活性物質(zhì)的研究。E－mail:yanfa8＠xianzhilou．com

**通信作者：李曄（1971－），男，本科，高級(jí)工程師，主要從事靈芝等食（藥）用真菌栽培、深加工及活性物質(zhì)的研究。E－mail:lee＠xianzhilou．com

2016－09－10